本發(fā)明涉及化妝品，特別涉及一種具有表觀遺傳作用機制的石榴發(fā)酵物。

背景技術：

1、表觀遺傳學是指不涉及dna序列改變的基因或者蛋白表達的變化，并可以在發(fā)育和細胞增殖過程中穩(wěn)定傳遞的遺傳學分支學科。表觀遺傳學的主要內容分為基因轉錄過程的調控和基因轉錄后的調控兩部分。表觀遺傳學的調控、修飾等參與了生命過程中一系列的重要進程，包括發(fā)育、造血、器官形成、凋亡和細胞增殖、衰老等。近年來，表觀遺傳學研究較多的主要是dna甲基化、組蛋白修飾、微小rna調控等。

2、dna?甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，它在調控基因表達和細胞功能中發(fā)揮著關鍵作用。dna甲基化是指在dna甲基化轉移酶（dnmts：包括dnmt1，dnmt2，dnmt3a，dnmt3b）的作用下將s-腺苷甲硫氨酸（sam）的一個甲基轉移至胞嘧啶5號碳原子上，形成5甲基胞嘧啶（5mc）。通常高甲基化抑制基因的表達，低甲基化促進基因表達，dna的甲基化狀態(tài)在生物發(fā)育的某階段或細胞分化的某種狀態(tài)下是可以逆轉的。隨著年齡的增長，皮膚細胞中的dna?甲基化模式會發(fā)生改變，這些變化與基因表達的異常和細胞功能的下降緊密相關，最終導致皮膚老化的特征。

3、dna甲基轉移酶1（dnmt1）是一種關鍵的酶，它在細胞分裂過程中復制dna時，負責將甲基化標記從原有的dna鏈傳遞到新合成的dna鏈上，從而保持細胞的表觀遺傳記憶。有研究發(fā)現(xiàn)，適度地抑制?dnmt1?的活性，可能有助于恢復細胞的原始甲基化狀態(tài)，進而促進細胞的再生和修復，對抗老化現(xiàn)象。

4、dna甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳機制，也是被研究和了解最多的一種機制。以往表觀遺傳學的應用以往多集中在疾病治療、新藥開發(fā)等病理性研究領域。近年來，表觀遺傳學在皮膚抗衰機制的研究中開始受到關注，但關于抑制dna甲基化作用機制的化妝品用活性成分還少有研究報道。

5、組蛋白修飾是表觀遺傳學研究的另一個重要方向，包括乙?；⒓谆?、磷酸化以及核糖基化等。已有研究表明cdk1磷酸化參與表觀遺傳調控的蛋白，可通過表觀遺傳修飾的機制影響其它基因的表達，具有維持表觀遺傳特性的功能。cdk1作為一個激酶，參與調控細胞周期的過程。正常細胞周期包括細胞分裂、分化、凋亡或焦亡過程，可受多種調節(jié)蛋白的調控。特定基因或整個基因組的dna甲基化、組蛋白修飾及非編碼rnas(non-codingrnas，ncrnas)作用等表觀遺傳機制在細胞周期過程中發(fā)揮重要作用，這些機制的改變使細胞周期失調，導致細胞生長紊亂，引起表觀遺傳修飾異常。細胞周期的停滯關鍵在于cdk1和cdk4的數(shù)量和活力下降，因而激活cdk1和cdk4有助于重啟有秩序的細胞周期，恢復表觀遺傳作用。

6、但目前通過抑制dna甲基化作用，激活cdk1基因表達，恢復表觀遺傳作用的化妝品用天然植物發(fā)酵原料還少有研究報道。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術問題是，提供一種可以抑制dna甲基化作用，提升cdk1基因表達，具有表觀遺傳作用機制的石榴發(fā)酵物。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種具有表觀遺傳作用機制的石榴發(fā)酵物，其特征在于采用以下方法制備：

3、a、新鮮的成熟石榴果去皮，稱取300-500克果肉，使用破壁機破壁勻漿處理，得到石榴果漿，68-70℃巴氏殺菌30-40min；

4、b、向步驟a所述石榴果漿中加入3-6g/l混合乳酸桿菌、10-20g/l酪蛋白和25-50g/l果糖，使用l-精氨酸調節(jié)發(fā)酵液ph為6-8，在36.5-37.7℃下，培養(yǎng)48-72h，期間使用高效液相色譜測試發(fā)酵液中的尿石素a含量，以尿石素a達到12g/l為發(fā)酵終點；所述混合乳酸桿菌由羅伊氏乳桿菌atcc?pta6475、乳酸桿菌atcc?53103、植物乳桿菌atcc?8014按質量比1:1:1混合而成；

5、c、使用300目濾布過濾，得到石榴果發(fā)酵液；

6、d、采用真空冷凍干燥機，將溫度調至-80~-60℃將所述石榴果發(fā)酵液進行真空冷凍干燥，凍干時間為48?h，得發(fā)酵物干基；

7、e、將所述發(fā)酵物干基和體積百分濃度為85%的乙醇，按質量比1:5~20混合溶解，使用300目濾布，過濾去除醇不溶物，醇溶物再次使用真空冷凍干燥機進行凍干，凍干溫度為-80~-60℃，脫去乙醇和水分，得到精制的石榴果發(fā)酵物干基；

8、f、按質量比1:4-10，稱取步驟e所得石榴果發(fā)酵物干基和麥芽糊精，將它們機械混合均勻，得預混合物，將所述預混合物與去離子水按質量比1:50進行混合溶解，溶解完全后進行噴霧干燥，噴霧干燥的條件為：進風溫度120-160℃、出口溫度60-90℃、進料速度300-400ml/h、噴霧工作壓力0.3-0.5mpa、風量2.5立方米/分鐘，控制噴干粉水分不高于3%，所得噴干粉即為具有表觀遺傳作用機制的石榴發(fā)酵物。

9、所述具有表觀遺傳作用機制的石榴發(fā)酵物在化妝品中的應用，可以抑制dna甲基化作用、提升cdk1基因表達。

10、本發(fā)明所述酪蛋白，cas號：9000-71-9，來源于牛奶，純度≥90%。

11、本發(fā)明所述果糖，cas號：57-48-7，純度≥90%。

12、本發(fā)明所述l-精氨酸cas號：74-79-3，分析純；本發(fā)明所述麥芽糊精，為西王集團生產，符合gb/t?20884標準；本發(fā)明所述真空冷凍干燥機為寧波新芝生物科技股份有限公司生產，型號為scientz-100fb-s。

13、本發(fā)明所述噴霧干燥機為浚和（上海）儀器科技有限公司生產，型號為ah-pilot。

14、本發(fā)明的有益效果在于，制備得到的石榴果發(fā)酵物，可以抑制dna甲基化，提升cdk1基因表達，具有表觀遺傳作用機制。

15、為證實本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明進行了如下實驗。

16、dna甲基化測試：

17、本實驗利用人永生化角質形成細胞建立實驗模型，其測試方法為，將測試樣品和對照樣品分別用水稀釋到0.005%（質量百分比），作用于人永生化角質細胞后，檢測?dnmt1基因相對表達量，來評價樣品是否具有抑制dna甲基化作用。

18、接種人永生化角質細胞至?6孔板中(6×105個孔)，于37oc，5%co2孵育?24?h。孵育結束后，去培養(yǎng)基，d-hanks?清洗1-2次，正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，樣品組中加入含有樣品的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)于37oc，5%?co2孵育?24h。

19、提取各實驗組總rna，合成?cdna，利用?q-pcr技術檢測分別測定內參物β-actin和目標基因dnmt1的基因相對表達量。

20、表1?測試樣品和對照樣品

21、 測試樣品1 本發(fā)明實施例1制備的石榴發(fā)酵物 測試樣品2 本發(fā)明實施例2制備的石榴發(fā)酵物 測試樣品3 本發(fā)明實施例3制備的石榴發(fā)酵物 測試樣品4 本發(fā)明實施例4制備的石榴發(fā)酵物 測試樣品5 本發(fā)明實施例5制備的石榴發(fā)酵物 對照樣品1 市售石榴發(fā)酵物 對照樣品2 其他按本發(fā)明實施例2，但只采用單一乳酸桿菌，即羅伊氏乳桿菌atcc?pta6475發(fā)酵的石榴發(fā)酵物 對照樣品3 其他按本發(fā)明實施例2，但只采用單一乳酸桿菌，即乳酸桿菌atcc?53103發(fā)酵的石榴發(fā)酵物 對照樣品4 其他按本發(fā)明實施例2，但只采用單一乳酸桿菌，即植物乳桿菌atcc?8014發(fā)酵的石榴發(fā)酵物 對照樣品5 其他按本發(fā)明實施例2，但羅伊氏乳桿菌atcc?pta6475、乳酸桿菌atcc?53103、植物乳桿菌atcc?8014按質量比0.5:1:5

22、表2?dnmt1基因相對表達量

23、 測試樣品 dnmt1基因相對表達量 p值 檢測結果 測試樣品1 0.781 ＜0.05 顯著 測試樣品2 0.752 ＜0.05 顯著 測試樣品3 0.739 ＜0.05 顯著 測試樣品4 0.699 ＜0.05 顯著 測試樣品5 0.716 ＜0.05 顯著 對照樣品1 0.992 ＞0.05 不顯著 對照樣品2 0.986 ＞0.05 不顯著 對照樣品3 0.975 ＞0.05 不顯著 對照樣品4 0.987 ＞0.05 不顯著 對照樣品5 0.979 ＞0.05 不顯著

24、由表2可知，本發(fā)明實施例制備的石榴發(fā)酵物對dnmt1基因相對表達量與正常對照組相比顯著降低，而非本發(fā)明的石榴發(fā)酵物或者不采用本發(fā)明制備工藝的石榴發(fā)酵物對dnmt1基因相對表達量作用不明顯，說明本發(fā)明制備的石榴發(fā)酵物具有降低dnmt1基因相對表達量的作用，即具有抑制dna甲基化作用。

25、cdk1基因表達測試：

26、本實驗利用人真皮成纖維細胞構建實驗模型，通過檢測cdk1基因相對表達量來評價樣品具有提升cdk1基因表達的作用。

27、1.細胞接種至6孔板中(6×105個孔)，于37oc，5%co2孵育24h。

28、2.去除培養(yǎng)液，用?d-hanks?輕柔沖洗細胞一次或兩次。正常對照組更換為新鮮培養(yǎng)基，樣品組更換為含樣品的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)于37oc，5%co2孵育24h。

29、3.提取各實驗組總rna，合成cdna，利用q-pcr技術檢測內參物β-actin?和目的基因cdk1的相對表達量。

30、表3?cdk1基因相對表達量測試值

31、 測試樣品 cdk1基因相對表達量 p值 檢測結果 測試樣品1 1.49 ＜0.01 顯著 測試樣品2 1.53 ＜0.001 顯著 測試樣品3 1.57 ＜0.001 顯著 測試樣品4 1.61 ＜0.001 顯著 測試樣品5 1.55 ＜0.001 顯著 對照樣品1 1.06 ＞0.05 不顯著 對照樣品2 1.08 ＞0.05 不顯著 對照樣品3 1.11 ＞0.05 不顯著 對照樣品4 1.09 ＞0.05 不顯著 對照樣品5 1.06 ＞0.05 不顯著

32、由表3可知，本發(fā)明實施例制備的石榴發(fā)酵物對cdk1基因相對表達量與正常對照組相比顯著增加，而非本發(fā)明的石榴發(fā)酵物或者不采用本發(fā)明指標工藝的石榴發(fā)酵物對cdk1基因表達作用不明顯，說明本發(fā)明制備的石榴發(fā)酵物具有提升cdk1基因表達的作用，樣品具有提升cdk1基因表達的作用。

33、由表2和表3可知，本發(fā)明的石榴發(fā)酵物可以抑制dna甲基化作用，提升cdk1基因表達，具有表觀遺傳作用機制。