重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用溶液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域。特別是涉及一種重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的外 用溶液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚覆蓋全身，它使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生 物性的侵襲。皮膚具有兩個(gè)方面的屏障作用：一方面防止體內(nèi)水分，電解質(zhì)和其他物質(zhì)丟 失；另一方面阻止外界有害物質(zhì)的侵入。保持著人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定上，在生理上起著重要的 保護(hù)功能，同時(shí)皮膚也參與人體的代謝過程。
[0003] 然而皮膚受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒燙傷以及某些疾病例如糖尿病引起的皮膚潰瘍會(huì)給患 者帶來身體和精神上的巨大影響。因此，對(duì)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)是醫(yī)藥領(lǐng)域十分關(guān)注的問題。
[0004] 自上世紀(jì)末開始，已對(duì)創(chuàng)傷后的組織修復(fù)過程、發(fā)生機(jī)制和治療等進(jìn)行了多種研 究，目前對(duì)創(chuàng)傷愈合的過程的研究認(rèn)識(shí)為創(chuàng)傷愈合包括表皮與締結(jié)組織增生及血管再生三 方面。原來相對(duì)靜止的各種細(xì)胞被激活，表型發(fā)生變化，如成纖維細(xì)胞經(jīng)歷增殖、遷移、產(chǎn)生 細(xì)胞間質(zhì)、轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞或凋亡諸階段。細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換與局部微環(huán)境及細(xì)胞自身產(chǎn) 生的生長(zhǎng)因子密切相關(guān)，故用重組生長(zhǎng)因子治療創(chuàng)傷愈合有重大意義。
[0005] 在傳統(tǒng)的創(chuàng)傷修復(fù)治療中，均以抗感染和增強(qiáng)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)及創(chuàng)面局部保護(hù)等措施使 創(chuàng)面自然愈合，是一個(gè)被動(dòng)的愈合過程。一般愈合時(shí)間較長(zhǎng)，而且容易留下疲痕和導(dǎo)致色素 沉著，同時(shí)對(duì)受損傷的皮膚附屬功能器官的功能恢復(fù)也不是十分有效。
[0006] 目前陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種生長(zhǎng)因子，對(duì)其生理功能、作用機(jī)制和基因調(diào)控等的研究逐 漸深入，它們?cè)趧?chuàng)傷修復(fù)中起著舉足輕重的作用，調(diào)控著創(chuàng)傷修復(fù)的各個(gè)階段。隨著細(xì)胞生 長(zhǎng)因子類藥物的出現(xiàn)，在不排除傳統(tǒng)治療方法的情況下，為創(chuàng)面愈合的治療帶來一條全新 的思路，即將創(chuàng)面修復(fù)由被動(dòng)修復(fù)變?yōu)橹鲃?dòng)修復(fù)。目前，已構(gòu)建了多種促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)、 血管化和再上皮化的基因，例如表皮細(xì)胞因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 等。
[0007] 重組牛喊性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Recombinant bovine basic fibroblast growth factor，簡(jiǎn)寫為rb-bFGF)是由含有高效表達(dá)牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的大 腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后得到的活性因子，它能誘導(dǎo)微血管的形成、發(fā)育和分化， 同時(shí)直接刺激成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白合成，以形成膠原纖維，增加創(chuàng)面的抗張力 強(qiáng)度，并促進(jìn)真皮細(xì)胞的移行、分裂、分化，以完成皮膚的修復(fù)過程，并能促進(jìn)皮膚軟骨組 織、骨組織和神經(jīng)組織損傷修復(fù)和肢體再生。大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)，bFGF對(duì)燒傷、 外傷及各種慢性難愈合創(chuàng)面具有顯著的促修復(fù)作用，并且安全、有效、無不良反應(yīng)。
[0008] 研究發(fā)現(xiàn)重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能刺激創(chuàng)面愈合過程中幾乎所有的細(xì) 胞反應(yīng)，已有大量的實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)燒燙傷創(chuàng)面愈合，特別是對(duì)那些用傳統(tǒng)方法無效的難愈 性的慢性潰瘍，有很好的治療作用。其作用機(jī)制是促進(jìn)創(chuàng)面的主動(dòng)修復(fù)愈合，與傳統(tǒng)的被動(dòng) 修復(fù)藥物在作用機(jī)理上有原則上的區(qū)別。rb-bFGFrb-bFGF可促進(jìn)創(chuàng)面愈合，用于燒傷創(chuàng)面 (包括淺II度、深I(lǐng)I度、肉芽創(chuàng)面)、慢性創(chuàng)面(包括體表慢性潰瘍等)和新鮮創(chuàng)面(包括外傷、 供皮區(qū)創(chuàng)面、手術(shù)傷等)。另外，rb-bFGF與傳統(tǒng)的創(chuàng)面修復(fù)藥物有協(xié)同作用，可能獲得比傳 統(tǒng)藥物更好的愈合質(zhì)量。因此，rb-bFGF將成為治療創(chuàng)面愈合的一種新型藥物。但此類活 性蛋白物質(zhì)包括酶、疫苗、生長(zhǎng)因子等的保存條件一直是此類物質(zhì)應(yīng)用的瓶頸，也是目前蛋 白技術(shù)研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)在的活性蛋白類物質(zhì)保存一般用凍干后呈固體狀態(tài)低溫保存，生產(chǎn) 成本高且使用不方便。
[0009] 為此，現(xiàn)有技術(shù)中也公開了一些適合在低溫條件下保存的rb-bFGF外用溶液劑 型，中國(guó)專利申請(qǐng)201110342458. 1公開了一種重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用溶液， 但是其穩(wěn)定性和安全性有待進(jìn)一步提高。因此，開發(fā)一種含rb-bFGF的外用溶液，克服上述 現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 的外用溶液，其原料配伍合理，穩(wěn)定性好，且能快速、持久、有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合，增加了病 人的順應(yīng)性。
[0011] 本發(fā)明通過如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題： 一種重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的外用溶液，每15毫升所述外用溶液中包含的 組分及用量為： 重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子40000~80000 IU ; 人血白蛋白l~5mg ; 甘露醇 250~350mg ; 右旋糖酐-70 20~25mg ; 磷酸氫二鈉80~100mg ; 磷酸二氫鈉45~55mg ; 加注射水至15mL ; 其中，所述外用溶液的pH值為7.0。
[0012] 作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，每15毫升所述外用溶液中包含的組分及用量為： 重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子63000 IU ; 人血白蛋白3mg ; 甘露醇300mg ; 右旋糖酐-70 22. 5mg ; 磷酸氫二鈉80mg ; 磷酸二氫鈉45mg ; 加注射水至15mL ; 其中，所述外用溶液的pH值為7.0。
[0013] 本發(fā)明還提供了重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的外用溶液的制備方法，包括如 下步驟： (1) 將處方量的甘露醇分散于注射用水中，在121°c熱壓滅菌，冷卻后備用； (2) 將處方量的重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子原液、人血白蛋白、右旋糖酐-70、磷酸 氫二鈉、磷酸二氫鈉溶于注射用水中，然后與步驟（1)所得的溶液混合，保證每15毫升溶液 中含有重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子63000 IU ;此過程中采用IM的鹽酸溶液/氫氧化 鈉溶液對(duì)溶液的pH進(jìn)行調(diào)整，保證外用溶液的pH為7. 0 ; (3) 使用0. 22 μ m濾膜除菌過濾2次，收集濾液； (4) 濾液按照規(guī)格分裝； 上述步驟均在無菌條件下操作。
[0014] 本發(fā)明通過試驗(yàn)例1考察了本發(fā)明rb-bFGF外用溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)性燒傷豚鼠模型創(chuàng)面 愈合情況的影響，結(jié)果表明（見表1):與模型對(duì)照組相比，各治療組5d、10d創(chuàng)面愈合率以及 創(chuàng)面愈合時(shí)間都具有極顯著性差異（P〈〇. 01)，這表明各治療組均可以作為治療燒燙傷疾病 的藥物使用。由此可見，本發(fā)明給出的rb-bFGF外用溶液在增加愈合率和降低愈合時(shí)間方 面都具有顯著的優(yōu)勢(shì)，其中尤其以rb-bFGF外用溶液A組即實(shí)施例1制備的rb-bFGF外用 溶液的效果最為顯著，愈合率最高，愈合時(shí)間最短。愈合時(shí)間是評(píng)價(jià)燒燙傷藥物最重要的指 標(biāo)之一。愈合時(shí)間越小，表明藥物治療效果越好，不僅能夠降低患者的治療費(fèi)用，并且大大 減小對(duì)患者的生活、工作和學(xué)習(xí)影響程，提高患者的生活質(zhì)量。
[0015] 本發(fā)明通過試驗(yàn)例2考察了本發(fā)明rb-bFGF外用溶液治療燒燙傷臨床志愿者試驗(yàn) 研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示(見表2):從I度燒燙傷治療效果看，治療2組的治愈率為100%，18位 臨床志愿者均不留疤痕；淺II度燒燙傷治療效果看，治療4組的治愈率為95. 00%，高于治療 3組的5. 00%，疤痕率為5. 00%，20位臨床志愿者中僅有1位留疤痕?？梢?，本發(fā)明rb-bFGF 外用溶液在提高治愈率和燒傷后的留疤問題方面取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。疤痕問題一 直是困擾燒燙傷患者的最大心理障礙，通過臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明rb-bFGF外用溶液 不僅短期治愈率高，愈合時(shí)間短，更重要的是疤痕率很低，這與本發(fā)明原料之間配伍使用起 到了改善局部血供、去腐生肌的功效。
[0016] 因此，相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下的優(yōu)點(diǎn)和效果： 本發(fā)明外用溶液中的以人血白蛋白作為rb-bFGF的蛋白保護(hù)劑，能夠保證rb-bFGF在 溶液狀態(tài)下低溫保存時(shí)的性能和療效，以甘露醇和右旋糖酐-70作為rb-bFGF的溶液保護(hù) 劑，且甘露醇和右旋糖酐-70之間的優(yōu)選配比為13:1，兩者協(xié)同，提高了體系的穩(wěn)定性，使 得本發(fā)明外用溶液的保質(zhì)期延長(zhǎng)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。本發(fā)明rb-bFGF外用溶液各原料配伍 最優(yōu)化，其穩(wěn)定性好，能快速、持久、有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合，提高愈合率，降低疤痕率，縮短愈 合時(shí)間，具有良好的療效。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下通過【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。在 本發(fā)明的范圍內(nèi)