基的電子自旋共振測定
[0044] 利用電子自旋共振（ESR)波譜解析技術(shù)，對癌前病變灶及整體的羥基自由基進(jìn)行 檢測。其中小劑量組所用顆粒劑的劑量為〇. 56g/kg體重，大劑量組所用顆粒劑的劑量為 I. 12g/kg體重。將維生素 C (VitC)給藥組作為陽性對照。
[0045] 如圖1所示，槲芪散可明顯降低癌前病變灶中自由基的含量。
[0046] 1. 3. 2對Y -谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶同功酶（Y -GT)的測定
[0047] Y -GT的活性與化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的癌變過程的病理變化密切相關(guān)，因此可作為化學(xué) 性致癌物質(zhì)誘發(fā)肝癌的陽性標(biāo)志。對肝切片作Y-GT組織化學(xué)染色觀察。由圖2可知，在 肝癌前病變模型組中，發(fā)現(xiàn)了彌漫性明顯染色，而在槲芪散治療組中染色區(qū)域明顯減少。
[0048] 1. 3. 3對肝癌前病變形態(tài)學(xué)變化的研究
[0049] 圖3顯示了對各組肝組織切片的HE染色結(jié)果，由圖3中可見，肝癌前病變模型組 中顯示出明顯的肝細(xì)胞增生，而經(jīng)過槲芪散治療后增生明顯減少。
[0050] 1. 3. 4對DEN誘導(dǎo)的大鼠肝臟中甲胎蛋白（AFP)的表達(dá)的研究
[0051] AFP是一種臨床上經(jīng)常進(jìn)行檢測分析的腫瘤標(biāo)志物，主要用于肝癌診斷和治療的 效果觀察。圖4顯示了 DEN誘導(dǎo)的大鼠肝臟中AFP的表達(dá)的免疫熒光法測量結(jié)果，由圖4 中可見，槲芪散可明顯抑制肝臟中AFP的表達(dá)。
[0052] 1. 4 結(jié)論
[0053] 上述實(shí)驗結(jié)果說明，槲芪散可以減少大鼠肝癌前病變部位的GGT灶的發(fā)生數(shù)和灶 面積，對羥自由基具有良好的清除作用，因此具有明顯阻斷肝癌前病變發(fā)生、發(fā)展的作用。
[0054] 實(shí)施例2 :槲芭散方劑的抗纖維化作用研究
[0055] 2. 1實(shí)驗材料
[0056] 使用與實(shí)施例1相同的方法制備槲芪散方劑。
[0057] 2. 2實(shí)驗方法
[0058] 選用6周齡的雄性大白鼠(動物來源于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心)，隨機(jī)分為對 照組、模型組和槲芪散（HQS)治療組。對照組不做任何處理，自由飲食、飲水；模型組和槲芪 散治療組分別進(jìn)行腹腔注射40%CC14-植物油溶液2ml/kg體重，每周2次，共8周，構(gòu)建肝纖 維化模型。造模第8周末通過形態(tài)學(xué)鑒定確定大鼠肝纖維化模型復(fù)制成功。第9周開始，治 療組經(jīng)灌胃給予肝臟纖維化大鼠槲芪散SgAkg體重，模型組灌胃給予等劑量的生理鹽水， 共8周。實(shí)驗第17周頸椎脫臼法處死所有動物，取出肝臟左前葉。采用HE染色、MASSON染 色方法觀察槲芪散對肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響 [0059] 2. 3實(shí)驗結(jié)果
[0060] 2. 3. 1大鼠肝臟大體形態(tài)變化（16周）
[0061] 如圖5所示，正常對照組大鼠肝臟表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地較軟，色暗紅，有光 澤。模型組大鼠肝臟表面較正常組欠光滑，顏色均較正常組淺，邊緣鈍，質(zhì)地硬，部分標(biāo)本表 面凹凸不平，呈小結(jié)節(jié)狀，黃褐色。槲芪散治療組大鼠肝臟表面較光滑，顏色較紅，無顆粒狀 結(jié)節(jié)。
[0062] 2. 3. 2對HE染色圖的研究（16周）
[0063] 如圖6所示，正常對照組肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈索狀分布，無明顯肝 細(xì)胞壞死，間質(zhì)無擴(kuò)增。模型組正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死， 炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞脂肪變性(空泡）散在分布，間質(zhì)增生明顯，纖維構(gòu)成的纖維間隔形成， 其破壞界板，分割、包繞肝小葉，形成較多完整的假小葉。槲芪散治療組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改 善，膠原纖維間隔較少，肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤少見，匯管區(qū)結(jié)締組織增生不明顯。
[0064] 2. 3. 3對MASSON染色圖的研究（16周）
[0065] 如圖7所示，Masson染色顯示正常對照肝小葉間和匯管區(qū)有極少量膠原纖維(藍(lán) 色）分布，肝小葉間未見纖維組織增生，無假小葉形成；模型組肝臟見匯管區(qū)大量膠原纖 維增生，增生的膠原纖維形成纖維分隔，破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，分割、包繞肝小葉，肝纖維化形 成。槲芪散治療組Masson染色膠原纖維含量明顯減少。
[0066] 2. 4 結(jié)論
[0067] 上述實(shí)驗結(jié)果說明，槲芪散具有逆轉(zhuǎn)肝纖維化、阻斷肝癌前病變的作用。
[0068] 實(shí)施例3 :槲芭散全方與柝方對大鼠肝癌前病奪的陽.斷作用的比較
[0069] 3. 1實(shí)驗材料
[0070] 全方槲芪散方劑（I):生黃芪30g，槲寄生30g，丹參20g，郁金10g，莪術(shù)6g，苦參 6g，水紅花子6g，白花蛇舌草20g。
[0071] 拆方槲芪散方劑（II):生黃芪30g，槲寄生30g，丹參20g，郁金10g，莪術(shù)6g，苦參 6g。
[0072] 使用與實(shí)施例1相同的方法將全方（I)與拆方（II)槲芪散方劑制成顆粒劑。使用 前用水稀釋成灌胃液，每ml含生藥0. 38g。
[0073] 3. 2實(shí)驗方法
[0074] 將80只雄性大白鼠(動物來源于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心)隨機(jī)分為7組，即模 型組、單純肝大部切除（PH)組、槲芪散方劑I號、II號治療組、I號、II號預(yù)防組和正常組， 其中I號治療組和預(yù)防組使用槲芪散全方，II號治療組和預(yù)防組使用槲芪散拆方。
[0075] 采用Solt-Faber實(shí)驗?zāi)Ｐ偷倪x擇程序。各組實(shí)驗大鼠腹腔一次性注射對二乙基 亞硝胺（DEN)200mg/kg體重，作為啟動劑。兩周后飼以含0.015%2_乙酰氨基芴（2-AAF)飼 料五周，實(shí)驗第三周末實(shí)施肝大部切除術(shù)（PH)。I號、II號治療組于PH后一周開始分別經(jīng) 胃飼給槲芪散方劑I號、II號，持續(xù)至實(shí)驗結(jié)束，連續(xù)給藥四周；I號、II號預(yù)防給藥組于造 模前一周開始給藥，持續(xù)至實(shí)驗結(jié)束，連續(xù)給藥八周；PH組于實(shí)驗第三周末單純施行肝大 部切除術(shù)，除此之外同正常組一樣進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，以作為單純肝損傷的對照組。第九周末， 禁食24小時后斷頸錐處死，在規(guī)定部位取肝組織、心臟采血，進(jìn)行檢測。
[0076] 3. 3實(shí)驗結(jié)果
[0077] 3. 3. 1病理研究
[0078] 取肝組織進(jìn)行病理組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的觀察。
[0079] 經(jīng)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，模型組肝臟顏色淺淡，表面粗糙，散在有灰白色小結(jié)節(jié)，直徑在1 毫米左右，質(zhì)地略硬；II號治療、預(yù)防組也可見散在灰白小結(jié)節(jié)；I號治療、預(yù)防組、正常組 無明顯的異常變化，PH組中新生出的肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)上與正常組相同。
[0080] 經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組肝細(xì)胞變性壞死明顯，有較為明顯的細(xì)胞增生灶， 細(xì)胞密集成團(tuán)，對附近肝細(xì)胞并不產(chǎn)生壓迫現(xiàn)象，但細(xì)胞喪失正常肝索結(jié)構(gòu)，血竇不明顯； II號治療、預(yù)防組肝臟中異常增生的肝細(xì)胞基本與模型組相同；I號治療、預(yù)防組異常增生 的肝細(xì)胞明顯減少。
[0081] 肝組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化如圖8所示。由圖8可以看出，模型組與II號預(yù)防、 治療組的肝細(xì)胞有程度不一的核變異，核膜不整齊，呈鋸齒形或波浪形，核仁增多，線粒體 腫脹，有巨大線粒體出現(xiàn)，部分線粒體較小，嵴欠清楚，不規(guī)則。而I號治療、預(yù)防組中肝細(xì) 胞核形基本規(guī)則，Mit正?；蜉p度腫脹變性。
[0082] 3. 3. 2組化表型的觀察
[0083] 對肝切片作Y-GT組織化學(xué)染色觀察。從圖9中可以看出，模型組中可見數(shù)量較 多的Y-GT染色陽性灶。II號治療、預(yù)防組γ-GT灶的數(shù)目及面積指標(biāo)低于模型組，但無顯 著差異。I號治療、預(yù)防組Y-GT灶明顯少于模型組，差別非常顯著(表1)。這表明I號藥 對DEN致肝癌前病變的發(fā)生有明顯的抑制作用。
[0084] 表1 :單位肝組織面積Y -GT酶改變灶數(shù)及面積
[0085]
【主權(quán)項】
1. 一種藥物組合物，所述藥物組合物由以下各單味中藥制成：生黃芪、槲寄生、丹參、 郁金、莪術(shù)、苦參、水紅花子、白花蛇舌草。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物由25-35重量份生黃芪、 25-35重量份槲寄生、15-25重量份丹參、8-12重量份郁金、15-25重量份白花蛇草制成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物由30重量份生黃芪、30 重量份槲寄生、20重量份丹參、10重量份郁金、6重量份莪術(shù)、6重量份苦參、6重量份水紅花 子、20重量份白花蛇舌草制成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物的劑型為湯劑、丸劑、散 齊?、膏劑、丹劑、酒劑、顆粒劑、口服液、膠囊劑、片劑或注射劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物的劑型為顆粒劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中，所述顆粒劑通過以下方法制造：向所述 藥物組合物加水，通過蒸汽加熱浸出，棄去藥渣，將所得浸出液濃縮并注入噴槍進(jìn)行噴霧制 粉，收集所得藥粉后進(jìn)一步制粒，制成所述顆粒劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中，所述浸出液在真空600mmHg、溫度65°C下 濃縮至波美14°~18°，比重為1. 12。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中，所述噴霧制粉的步驟在負(fù)壓20mmHg，70~ 80°C溫度下進(jìn)行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的藥物組合物在制造用于阻斷肝癌前病變、治療 肝癌或病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的應(yīng)用，其中所述肝癌前病變?yōu)楦卫w維化。
【專利摘要】本發(fā)明公開了藥物組合物槲芪散及其在制備用于阻斷肝癌前病變、治療肝癌或病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用，并證明槲芪散可以減少大鼠肝癌前病變部位的GGT灶的發(fā)生數(shù)和灶面積，對羥自由基具有良好的清除作用，因此具有明顯阻斷肝癌前病變發(fā)生、發(fā)展的作用。
【IPC分類】A61P35-00, A61K36-9066, A61P1-16, A61P31-12
【公開號】CN104707097
【申請?zhí)枴緾N201310693350
【發(fā)明人】錢英, 王學(xué)江, 豐平, 文朝陽, 朱淼, 韓玉英, 姜大巍
【申請人】首都醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2013年12月17日