異土木香內(nèi)酯在制備抗慢性粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種天然小分子化合物異土木香內(nèi)酯在制備抗慢性粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]白血病(Leukemia)是一類造血干細(xì)胞異常的惡性克隆性疾病。在我國(guó)白血病發(fā)病率逐年上升，約占總癌癥發(fā)病率的5%。其中，慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenousleukemia, CML)占成人白血病的20%。大約90%以上的CML患者可檢出特異性的費(fèi)城染色體(Philadelphia，Ph)，即t (9 ；22) (q34 ；qll)染色體易位，9號(hào)染色體長(zhǎng)臂的C-Abl基因移位至22號(hào)染色體上長(zhǎng)臂斷裂點(diǎn)集中區(qū)(BCR)產(chǎn)生致癌的BCR-ABL融合基因，有95%的慢性粒細(xì)胞性白血病患者被檢測(cè)有此染色體易位，該融合基因編碼的Bcr-Abl融合蛋白(Bcr-Abl fus1n protein)具有很強(qiáng)的絡(luò)氨酸蛋白激酶活性，是CML發(fā)病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
[0003]基于對(duì)Bcr-Abl蛋白分子結(jié)構(gòu)及其絡(luò)氨酸殘基功能的研宄，以它作為靶標(biāo)尋找治療CML的特效藥物成為相關(guān)領(lǐng)域研宄的重要熱點(diǎn)。上世紀(jì)90年代，Zimmermann研宄組經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)，小分子化合物伊馬替尼(Imatinib，Gleevec)能夠通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制Bcr-Abl蛋白與ATP結(jié)合來特異阻斷該融合蛋白的絡(luò)氨酸激酶活性，從而抑制CML細(xì)胞增殖并促使其凋亡，2001年美國(guó)FDA批準(zhǔn)其用于臨床治療CML。隨著Imatinib臨床療效獲得肯定的同時(shí)，也漸漸發(fā)現(xiàn)它的缺陷:Imatinib主要針對(duì)CML早期患者，中晚期患者對(duì)Imatinib完全緩解率低于30% ;部分患者可出現(xiàn)Imatinib耐藥且比例逐年上升，主要與BCR-ABL突變或基因擴(kuò)增過表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)Imatinib敏感性降低有關(guān)。針對(duì)這些問題，沿著既有的思路繼續(xù)開發(fā)新一代的革G向Bcr-Abl融合蛋白的絡(luò)氨酸激酶抑制劑，諸如Nilotinib，Dasatinib和Ponatinib新一代抑制劑的開發(fā)和上市，這固然是解決問題的一種選擇，但是鑒于既往的經(jīng)驗(yàn)，這種選擇并不能從根本上治愈CML。因?yàn)樵谶@種策略中，只是選擇性抑制Bcr-Abl的絡(luò)氨酸激酶活性，而沒有除去Bcr-Abl蛋白。
[0004]隨著細(xì)胞分子生物學(xué)知識(shí)的積累，現(xiàn)在通過特定的化合物誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的某種蛋白酶活性定點(diǎn)清除特定蛋白已成為可能，所以，尋求可誘導(dǎo)Bcr-Abl融合蛋白降解的小分子化合物已成為一種優(yōu)于只抑制它的活性的治療策略。這種策略不僅可以克服Bcr-Abl當(dāng)前各種點(diǎn)突變?cè)斐傻膶?duì)絡(luò)氨酸激酶抑制劑的耐藥性，同時(shí)它也是靶向Bcr-Abl融合蛋白治療CML的一種新策略，是一條充滿希望值得探索的新治療途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的。
[0006]本發(fā)明利用建立的GFP-Bcr-Abl篩選細(xì)胞系，提供了一種異土木香內(nèi)酯在制備抗慢性粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯抗CML活性是通過特異性誘導(dǎo)K562細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體活性來實(shí)現(xiàn)降解Bcr-Abl融合蛋白的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯能夠顯著抑制慢性粒初診患者及耐藥患者中Bcr-Abl陽性干細(xì)胞克隆的形成，這為通過異土木香內(nèi)酯天然小分子化合物誘導(dǎo)Bcr-Abl融合蛋白降解治療耐藥或復(fù)發(fā)CML患者提供了可能性。
[0007]本發(fā)明解決的技術(shù)問題包括:
[0008]1、篩選出能夠降解Bcr-Abl蛋白的單體化合物-異土木香內(nèi)酯；
[0009]2、驗(yàn)證異土木香內(nèi)醋對(duì)Bcr-Abl蛋白的降解效應(yīng)；
[0010]3、異土木香內(nèi)酯對(duì)CML細(xì)胞的效應(yīng)；
[0011]4、異土木香內(nèi)酯降解Bcr-Abl的可能機(jī)制；
[0012]5、異土木香內(nèi)酯抗CML耐伊馬替尼細(xì)胞的效應(yīng)。
[0013]本發(fā)明創(chuàng)造性解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:構(gòu)建GFP-Bcr-Abl融合蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞中，不同化合物處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后檢查熒光強(qiáng)度來篩選降解GFP-Bcr-Abl的化合物，得到可能誘導(dǎo)Bcr-Abl蛋白降解的化合物一異土木香內(nèi)酯。通過Western bloting技術(shù)檢測(cè)異土木香內(nèi)醋處理或未處理的K562細(xì)胞、伊馬替尼耐藥細(xì)胞中的Bcr-Abl，以Bcr-Abl蛋白量是否減少或消失來判斷異土木香內(nèi)醋對(duì)Bcr-Abl蛋白的降解效應(yīng)。通過CCK-8檢測(cè)異土木香內(nèi)酯處理的K562細(xì)胞來判斷它對(duì)細(xì)胞活力的影響；Annex-V、PI染色異土木香內(nèi)酯處理的K562細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡！Westernbloting檢測(cè)異土木香內(nèi)醋處理的K562細(xì)胞中的調(diào)亡Maker:Caspase_3和PARPtlReal timePCR檢測(cè)異土木香內(nèi)酯處理不同時(shí)相Bcr-Abl的mRNA水平；蛋白酶體抑制劑(MG132)、Caspase-3抑制劑(Z-VAD)、自噬抑制劑(3_MA，CQ)，對(duì)異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Bcr-Abl蛋白降解效應(yīng)的影響。磁珠分選CML患者骨髓⑶34陽性細(xì)胞，Western bloting檢測(cè)異土木香內(nèi)酯對(duì)CML干細(xì)胞中Bcr-Abl蛋白的降解效應(yīng)；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)異土木香內(nèi)酯對(duì)CML患者中干細(xì)胞形成克隆能力的影響。
[0014]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:
[0015]異土木香內(nèi)酯單體化合物降解Bcr-Abl蛋白具有以下特點(diǎn):
[0016]I)分子量較??；
[0017]2)毒性較低；
[0018]3)容易獲??；
[0019]4)可用于耐伊馬替尼CML患者。
【附圖說明】
[0020]圖1為異土木香內(nèi)醋(IsoA)的結(jié)構(gòu)(A)，IsoA分別處理轉(zhuǎn)染GFP-Vector (B)和GFP-BCR-ABL(C)的K562細(xì)胞，導(dǎo)致GFP-Bcr-Abl熒光信號(hào)減弱；
[0021]圖2為異土木香內(nèi)醋下調(diào)Bcr-Abl蛋白水平:(A) 5，10 μ M異土木香內(nèi)醋處理K562細(xì)胞不同時(shí)間，Western blot檢測(cè)Bcr-Abl蛋白；(B，C) 10 μ M異土木香內(nèi)酯處理K562R(B)和轉(zhuǎn)染T315I突變BCR-ABL(C)的32D細(xì)胞，檢測(cè)Bcr-Abl蛋白；
[0022]圖3為異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡:(A)K562細(xì)胞經(jīng)異土木香內(nèi)酯處理24、48小時(shí)檢測(cè)生長(zhǎng)抑制率；(B)K562細(xì)胞經(jīng)異土木香內(nèi)酯處理24、48小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；(C)Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白水平。
[0023]圖4為異土木香內(nèi)酯不改變Bcr-Abl的mRNA水平；
[0024]圖5為自噬抑制劑抑制異土木香內(nèi)酯引起的Bcr-Abl蛋白的降解:蛋白酶體抑制劑⑷和caspase抑制劑⑶不能抑制異土木香內(nèi)醋引起的Bcr-Abl