蛋白的降解；(C)自噬抑制劑CQ-3-MA抑制異土木香內(nèi)酯引起的Bcr-Abl蛋白的降解；
[0025]圖6為異土木香內(nèi)酯可抑制慢性粒細胞白血病患者干細胞的克隆形成:(A)磁珠分選CML患者骨髓CD34陽性細胞，異土木香內(nèi)酯處理或不處理分離到的CD34陽性細胞48小時，然后Western blot檢測Bcr-Abl蛋白；(C)異土木香內(nèi)醋處理慢性?；颊撷?4陽性細胞72小時，觀察異土木香內(nèi)酯對克隆形成能力的影響。
【具體實施方式】
[0026]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0027]為篩選能夠降解Bcr-Abl蛋白的天然小分子化合物，我們首先建立了一種能反映蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的細胞篩選模型:將GFP融合的BCR-ABL穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到K562細胞中，通過檢測綠色熒光的改變，篩選能夠降低Bcr-Abl蛋白水平的小分子。通過對一系列天然產(chǎn)物的篩選，我們發(fā)現(xiàn)一種天然小分子化合物一異土木香內(nèi)醋(Isoalantolactone，IsoA)，它能夠顯著減少GFP-Bcr-Abl綠色熒光信號(圖1)。異土木香內(nèi)酯從菊科旋復花屬植物土木香的根中分離得到，屬桉烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物(圖1)，是中藥土木香中的主要活性成分，含量高達1.2% -5.6%。藥理學研宄表明異土木香內(nèi)酯具有較強的驅(qū)蟲、抗原蟲、抗菌等活性。最近的研宄顯示，異土木香內(nèi)酯具有抗癌活性，可以誘導胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞死亡，而對正常細胞沒有明顯的毒性。在這里，我們首次發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯具有下調(diào)Bcr-Abl融合蛋白的效應(yīng)，為它應(yīng)用于革El向降解Bcr-Abl提供了可能的線索。
[0028]為證實異土木香內(nèi)醋下調(diào)GFP融合的Bcr-Abl蛋白，我們用western blotting檢測了異土木香內(nèi)酯對Bcr-Abl的蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯呈時間和劑量依賴性下調(diào)K562細胞中Bcr-Abl蛋白(圖2A)，同時也發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)醋能夠下調(diào)對Gleevec耐藥的K562R細胞中Bcr-Abl蛋白(圖2B)。更為重要的是，對于具有T315I突變的Bcr-Abl蛋白，異土木香內(nèi)酯處理同樣可以導致其減少(圖2C)。
[0029]Bcr-Abl蛋白對于CML的發(fā)病至關(guān)重要，它可以活化諸如PI3K/AKT/mT0R，NF-KB,JAK/STAT等多條信號傳導通路來促進細胞的存活和增殖。如三氧化二砷，HDAC抑制劑LBH589，雷公藤甲素，藤黃酸等多種化合物便是通過這些信號通路的抑制而誘導CML細胞死亡。為了解異土木香內(nèi)醋下調(diào)Bcr-Abl蛋白會產(chǎn)生何種效應(yīng)，用異土木香內(nèi)醋處理K562細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯可以抑制K562細胞生長，誘導K562細胞死亡(圖3)。
[0030]為探索異土木香內(nèi)醋下調(diào)Bcr-Abl蛋白的分子機制，用5_10 μ M濃度的異土木香內(nèi)酯處理Κ562細胞，檢測BCR-ABL的mRNA水平，數(shù)據(jù)表明，盡管Bcr-Abl蛋白在6小時開始減少(圖2)，同時伴隨凋亡相關(guān)蛋白的顯著改變(圖3)，而異土木香內(nèi)酯的處理并不影響B(tài)CR-ABL的mRNA水平(圖4)，這提示異土木香內(nèi)酯可能通過轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)Bcr-Abl蛋白，我們首先考慮異土木香內(nèi)酯可能通過誘導細胞內(nèi)的特異蛋白酶活性來降解Bcr-Abl蛋白。
[0031]細胞內(nèi)特定蛋白的降解一般通過泛素/蛋白酶體途徑和溶酶體途徑實現(xiàn)的，正如以前文獻報導的那樣，三氧化二砷和硫化砷通過革G向泛素E3連接酶c-CBL誘導Bcr-Abl蛋白降解，也可以通過自噬途徑促進Bcr-Abl蛋白降解，也有文獻報道活化的Caspase也可剪切Bcr-Abl蛋白。異土木香內(nèi)酯誘導Bcr-Abl蛋白的下調(diào)通過何種途徑實現(xiàn)，目前并不清楚。為回答此疑問，我們用蛋白酶體抑制劑、caspase抑制劑和自噬抑制劑來探索異土木香內(nèi)醋誘導Bcr-Abl蛋白蛋白下調(diào)的分子機制。數(shù)據(jù)顯示蛋白酶體抑制劑MG132和Caspase抑制劑都不能抑制異土木香內(nèi)酯誘導的Bcr-Abl蛋白降解；而自噬抑制劑CQ和3-MA可以顯著抑制異土木香內(nèi)酯誘導的Bcr-Abl蛋白降解(圖5)。這些結(jié)果表明，異土木香內(nèi)酯誘導的Bcr-Abl蛋白下調(diào)有可能是通過自噬相關(guān)的途徑降解而實現(xiàn)的。
[0032]當前CML治療失敗面臨的主要問題是耐藥的產(chǎn)生，慢急變的發(fā)生，這些問題歸根結(jié)底是在CML患者中存在Bcr-AbI陽性干細胞。為了解異土木香內(nèi)酯是否能作用于Bcr-AbI陽性干細胞，我們用磁珠分選的方法得到CML患者骨髓的CD34陽性細胞，然后用異土木香內(nèi)酉旨10 μΜ處理48小時，western bloting檢測Bcr-Abl蛋白的降解情況，同時用克隆形成實驗檢測異土木香內(nèi)酯對這些CD34陽性細胞克隆形成的影響。結(jié)果顯示異土木香內(nèi)酯不僅能降解⑶34陽性細胞中的Bcr-Abl蛋白，而且顯著抑制這些干細胞克隆形成能力。這表明了異土木香內(nèi)酯能夠通過降解CML患者中干細胞內(nèi)的Bcr-AbI蛋白發(fā)揮抑制CML患者中Bcr-Abl陽性干細胞的效應(yīng)，為克服CML治療過程中遇到耐藥和慢粒急變發(fā)生打下了堅實的工作基礎(chǔ)，也為根治CML提供了可能。
[0033]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.異土木香內(nèi)酯在制備抗慢性粒細胞性白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述異土木香內(nèi)酯特異性誘導慢性粒細胞內(nèi)自噬溶酶體活性，降解慢性粒發(fā)生和發(fā)展的分子一Bcr-Abl融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述異土木香內(nèi)酯可抑制Bcr-Abl融合蛋白陽性的干細胞克隆的形成。
【專利摘要】本發(fā)明利用建立的GFP-Bcr-Abl篩選細胞系，提供了一種異土木香內(nèi)酯在制備抗慢性粒細胞性白血病藥物中的應(yīng)用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯抗CML活性是通過特異性誘導K562細胞內(nèi)自噬溶酶體活性降解Bcr-Abl融合蛋白來實現(xiàn)的，同時發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯能夠顯著抑制慢性粒初診患者及耐藥患者中Bcr-Abl陽性干細胞克隆的形成，這為通過異土木香內(nèi)酯天然小分子化合物誘導Bcr-Abl融合蛋白降解治療耐藥或復發(fā)CML患者提供了可能性。
【IPC分類】A61K31-365, A61P35-02, A61P35-00
【公開號】CN104739825
【申請?zhí)枴緾N201510087482
【發(fā)明人】高豐厚, 吳英理, 韋煒, 張超, 盧靜, 劉珍
【申請人】上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年2月25日