徐長(zhǎng)卿c21甾體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐 藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，還涉及徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，它以細(xì)胞異常增殖和轉(zhuǎn)移為特 點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)資料表明，2000年全球新發(fā)惡性腫瘤病例約1000萬(wàn)，死亡620萬(wàn)， 患病2200萬(wàn)例；預(yù)計(jì)到2020年惡性腫瘤新發(fā)病例將達(dá)到1500萬(wàn)，死亡1000萬(wàn)，患病3000 萬(wàn)例?；熓菒盒阅[瘤綜合療法的方法之一，廣泛用于術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后，但腫瘤細(xì)胞多藥 耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重影響化療對(duì)惡性腫瘤的療效。克服腫瘤藥物的多藥耐藥，恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞 對(duì)藥物的敏感性，尋找高效低毒的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑是當(dāng)前腫瘤治療藥物的研宄方 向。
[0003] 腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和 作用機(jī)制完全不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是腫瘤難治愈的主要 原因之一，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，90%的癌癥化療失敗歸因于多藥耐藥。
[0004] 徐長(zhǎng)卿系蘿摩科Asclepiadaceae牛皮消屬植物徐長(zhǎng)卿 (Bge.)Kitag.的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為《中國(guó)藥典》2010年版所收載，味 辛，性溫，具有祛風(fēng)化濕，止痛止癢的功能，用于風(fēng)濕痹痛，胃痛脹滿，牙痛，腰痛，跌撲損傷， 蕁麻瘆，濕瘆?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床應(yīng)用主要集中在鎮(zhèn)痛和皮膚疾病等方面(張永清，等.中醫(yī)研 宄，2005,18 (11) :55-58.)，藥理研宄集中在其所含的化學(xué)成分丹皮酚上，研宄表明丹皮酚 具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗蛇毒、保護(hù)心血管和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用（曾粵. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2012,31 (11):125-126.)。已有文獻(xiàn)報(bào)道從徐長(zhǎng)卿中分離鑒定C21甾體類 化合物，但目前未見(jiàn)高含量徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)品；未見(jiàn)有關(guān)徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，開發(fā)利用迄今為止應(yīng)用尚 不廣泛的蘿摩科牛皮消屬植物徐長(zhǎng)卿謂(Bge. )Kitag.，尤其是其 C21甾體類成分。
[0006] 本案發(fā)明人通過(guò)對(duì)徐長(zhǎng)卿進(jìn)行細(xì)致深入的研宄，發(fā)明了高含量徐長(zhǎng)卿C21留體提 取物提取分離純化方法，制得的提取物經(jīng)藥理活性研宄證明具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作 用。在此基礎(chǔ)上，本案發(fā)明人制備了徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，比較了徐長(zhǎng)卿C21留體提取 物和徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用，結(jié)果表明徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)作用顯著增強(qiáng)，因而完成了本發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明目的在于提供徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆 轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明另一目的在于提供徐長(zhǎng)卿C21甾體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物制備方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為： 本發(fā)明提供的徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中C21留體苷元重量百分含量大于等于90%，制 備方法包括以下步驟：徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量為 徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的8倍體積量，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，分次濾過(guò)，提取液合并，減 壓回收乙醇，所得提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱DlOl色譜，填充大孔吸附樹脂DlOl 體積為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的〇. 5倍體積，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用 30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液， 經(jīng)已處理好的脫色樹脂D941柱色譜，填充脫色樹脂D941體積為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量 的〇. 5倍體積，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得洗脫物，洗脫物 加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液體積為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的2倍體積量，置80°C水浴 中加熱回流5小時(shí)，取出，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取5次，乙酸乙酯每次體積徐長(zhǎng)卿干 燥根和根莖重量的1倍體積量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
[0010] 本發(fā)明提供徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的用途。
[0011] 本發(fā)明的徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過(guò)下列研宄證明其具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥 耐藥作用，徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中C21留體苷元重量百分含量大于等于90%，通過(guò)下列 方法得到的：徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量為徐長(zhǎng)卿干 燥根和根莖重量的8倍體積量，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，分次濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙 醇，所得提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂柱DlOl色譜，填充大孔吸附樹脂DlOl體積為徐 長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的〇. 5倍體積，用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用30%乙醇 洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，經(jīng)已處 理好的脫色樹脂D941柱色譜，填充脫色樹脂D941體積為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的0. 5 倍體積，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得洗脫物，洗脫物加2 % 硫酸溶液水解，硫酸溶液體積為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的2倍體積量，置80°C水浴中加 熱回流5小時(shí)，取出，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取5次，乙酸乙酯每次體積徐長(zhǎng)卿干燥根 和根莖重量的1倍體積量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
[0012] 構(gòu)建人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR，采用MTT法測(cè)定人胃癌多藥耐藥細(xì)胞 株對(duì)阿霉素、5-氟尿嘧啶和順鉑的耐藥倍數(shù)分別為276. 28倍、3. 63倍和1. 56倍；構(gòu)建人結(jié) 腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR，采用MTT法測(cè)定人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)阿霉素、順鉑 和5-氟尿嘧啶的耐藥倍數(shù)分別為273. 66倍、4. 05倍和2. 92倍；構(gòu)建人肺癌多藥耐藥細(xì)胞 株A549/T，采用MTT法測(cè)定人肺癌多藥耐藥株對(duì)紫杉醇、阿霉素和順鉑的耐藥倍數(shù)分別為 7. 16 倍、5. 30 倍和 2. 14 倍。
[0013] 徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR對(duì)5-氟尿 嘧啶耐藥作用：?jiǎn)为?dú)5-氟尿嘧啶對(duì)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR半數(shù)抑制濃度為 29. 63±0. 83 #g/ml;5_氟尿嘧啶聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物50 #g/ml對(duì)人胃癌多藥 耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR半數(shù)抑制濃度為0. 42±0. 12 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為70. 54倍；5-氟 尿嘧啶聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體提取物50 #g/ml對(duì)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR半數(shù) 抑制濃度為1. 67 ±1. 53 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為17. 86倍。
[0014] 徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR對(duì)5-氟尿 嘧啶耐藥作用：?jiǎn)为?dú)5-氟尿嘧啶對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為 31.87±1.49 #g/ml; 5-氟尿嘧啶聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌 多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為0. 31±0. 05 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為102. 81倍； 5-氟尿嘧啶聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體提取物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR 半數(shù)抑制濃度為〇. 37±0. 06 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為86. 14倍。
[0015] 徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR對(duì)阿霉素耐 藥作用：?jiǎn)为?dú)阿霉素對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為145. 04±9. 64 #g/ml;阿霉素聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株 此1'-8八〇?半數(shù)抑制濃度為0.84±0.13/^/1111，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為172.67倍；阿霉素聯(lián)合徐 長(zhǎng)卿C21留體提取物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為 1.36±0. 16 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為 106. 65 倍。
[0016] 徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR對(duì)順鉑耐藥 作用：?jiǎn)为?dú)順鉑對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為19. 73±0. 81 ^g/ ml;順鉑聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR 半數(shù)抑制濃度為I. 19±0. 04 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為16. 58倍；順鉑聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體提取 物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為1.54±0.09 #g/ml， 逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為12. 81倍。
[0017] 徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)人肺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/T對(duì)紫杉醇耐藥作用： 單獨(dú)紫杉醇對(duì)人肺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/T半數(shù)抑制濃度為41. 15±1. 04 #g/ml;紫杉 醇聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物50 #g/ml對(duì)人肺癌多藥耐藥細(xì)胞株A549/T半數(shù)抑制濃度 為13. 14±2.62 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3. 13倍；紫杉醇聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C