A或蛋白質(zhì) 均一化表達(dá)量比后者少（即腫瘤組織較癌旁非瘤組織的ZAP均一化表達(dá)量比值〈1)，則屬 于ZAP低表達(dá)，適于利用Ml進(jìn)行治療。更為有效的治療對(duì)象為腫瘤組織較癌旁非瘤組織的 ZAP均一化表達(dá)量比值〈0. 8的腫瘤，更優(yōu)選〈0. 6,更優(yōu)選〈0. 4,更優(yōu)選〈0. 3,更優(yōu)選〈0. 2， 更優(yōu)選〈〇. 1，最為優(yōu)選的，是腫瘤組織ZAP陰性。這些腫瘤組織與相應(yīng)癌旁非瘤組織包括 但不限于病理穿刺手術(shù)或外科切除手術(shù)來源組織樣本。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在有些腫瘤組織中 ZAP表達(dá)量甚至高于癌旁非瘤組織，這些腫瘤或腫瘤患者將不適宜直接利用Ml進(jìn)行治療。
[0029] ZAP mRNA或蛋白檢測(cè)方法包括但不限于QRT_PCR、Northern Blot、Western Blot、 免疫組織化學(xué)、ELISA等。為準(zhǔn)確判定不同樣本之間ZAP mRNA或蛋白數(shù)量的差異，首先計(jì)算 出每一個(gè)樣本ZAP mRNA或蛋白的均一化表達(dá)量。均一化表達(dá)量是指每個(gè)樣本的ZAP mRNA 或蛋白值和樣本內(nèi)參ZAP mRNA或蛋白平相除，進(jìn)行均一化處理得出該樣本ZAP均一化表達(dá) 量。在不同檢測(cè)方法中內(nèi)參可以不同，其共同特征是在不同細(xì)胞或組織樣本中內(nèi)參表達(dá)量 一致，這樣經(jīng)過均一化處理的不同樣本的ZAP表達(dá)量才具備可比性，用于判斷樣本之間ZAP mRNA或蛋白的數(shù)量差異。
[0030] 在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例中（圖4)，Ml病毒對(duì)人離體培養(yǎng)的活肝癌組織和 結(jié)直腸癌組織具有不同的抑制生長(zhǎng)效果（表2和表3)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率超過10 %的樣本合 計(jì)達(dá)到32例，而腫瘤生長(zhǎng)抑制率小于等于10 %的19例。進(jìn)一步通過QRT-PCR方法分析這 兩組每個(gè)腫瘤組織中ZAP和內(nèi)參mRNA的表達(dá)水平（各自，用每個(gè)樣本的2<h ap除以 2#^#獲得各自ZAP均一化表達(dá)量。對(duì)上述兩組樣本的ZAP均一化表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)， 抑制率超過10%樣品組的ZAP均一化表達(dá)量為0. 117±0. 890,低于抑制率小于等于10%組 (0· 791 ±0. 108)，二者均數(shù)比值為 0· 148。
[0031] 作為另一種可選的方式，腫瘤的ZAP高、低或陰性表達(dá)指腫瘤細(xì)胞（例如來源于腫 瘤患者的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞）與正常細(xì)胞比較，ZAP mRNA和蛋白質(zhì)的數(shù)量多、少或者無表達(dá)。若 前者的ZAP的mRNA或蛋白質(zhì)均一化表達(dá)量比后者少（即腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞的ZAP均一 化表達(dá)量比值〈1)，則屬于ZAP低表達(dá)，適于利用Ml進(jìn)行治療。更為有效的治療對(duì)象為腫瘤 細(xì)胞較正常細(xì)胞的ZAP均一化表達(dá)量比值〈0. 8的腫瘤，更優(yōu)選〈0. 6,更優(yōu)選〈0. 4,更優(yōu)選 〈0. 3,更優(yōu)選〈0. 2,更優(yōu)選〈0. 1，最為優(yōu)選的，是腫瘤細(xì)胞ZAP陰性。
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例中（圖3c)，運(yùn)用Western Blot方法測(cè)定HepG2肝 癌細(xì)胞細(xì)胞株和L-02正常肝細(xì)胞株ZAP蛋白表達(dá)水平差異，同時(shí)測(cè)定作為不同樣本之間表 達(dá)量一致的標(biāo)準(zhǔn)參照β -actin，Western blot檢測(cè)條帶灰度代表被檢測(cè)分子數(shù)量，ZAP均 一化蛋白表達(dá)量=ZAP條帶灰度平均值/ β -actin條帶灰度平均值。HepG2的ZAP均一化 蛋白表達(dá)量與L-02的比值為0. 8, ZAP在H印G2低表達(dá)。在感染Ml病毒后，！fep G2細(xì)胞 存活率只有70. 4% ± 3. 5 %，而同樣處理的L-02存活率達(dá)100. 3 ± 10. 0 %，二者存活率差異 具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0033] 在另一個(gè)示例性實(shí)施例中（圖3a和圖3b)，腫瘤細(xì)胞株T24、SCaBER、LoVo和H印3B 的ZAP無論mRNA(圖3a)還是蛋白質(zhì)（圖3b)在通過QRT-PCR和Western blot檢測(cè)后，分 別與各自內(nèi)參比較后的均一化表達(dá)量為未檢出或接近于〇 (〈〇. 1)，即ZAP表達(dá)陰性或接近 陰性（〈0.1 ) ;M1感染后這些腫瘤細(xì)胞后引起細(xì)胞死亡，細(xì)胞存活率顯著下降到T2421. 1%、 SCaBER 11. 5%、LoVo 6. 9%和H印3B 3.8% (表1)。而圖3a和圖3b中的正常細(xì)胞L-02 和HEB中ZAP無論mRNA (圖3a)還是蛋白質(zhì)的均一化表達(dá)量與上述腫瘤細(xì)胞的比值大于1， 屬于ZAP高表達(dá)，在Ml感染后沒有引起這些正常細(xì)胞存活率明顯下降，L-02為100. 3%， HEB98. 8% (表 1)。
[0034] 由此，發(fā)明同時(shí)提供了一種抗腫瘤用藥系統(tǒng)，其特征在于包括ZAP表達(dá)水平檢測(cè) 試劑，以及甲病毒；所述的甲病毒為Ml病毒或蓋塔病毒。通過先檢測(cè)患者腫瘤的ZAP表達(dá) 水平，再針對(duì)性地采取合適的給藥方案。
[0035] 同時(shí)，發(fā)明還提供了一種抗腫瘤藥物，其包括甲病毒和ZAP抑制劑；所述甲病毒為 Ml病毒或蓋塔病毒。所述的ZAP抑制劑為ZAP表達(dá)或功能抑制劑、ZAP干擾片段或者ZAP 抗體等。
[0036] 為了避免Ml病毒同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用，優(yōu)選地，所給予的ZAP抑制劑針對(duì) 性地給予或靶向于腫瘤組織，為腫瘤靶向性ZAP抑制劑。
[0037] 作為可選的實(shí)施方案，本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物可以是注射劑、片劑、膠囊、貼 劑等。作為優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的抗腫瘤藥物是注射劑；優(yōu)選地，可采用靜脈注射。
[0038] 作為可選的給藥方式，本發(fā)明Ml病毒可以通過靜脈或瘤內(nèi)注射方式給藥。瘤內(nèi) 注射方式每天給予2 X 105PFU/kg~2 X 109PFU/kg ;以靜脈注射的方式每天給予2 X IO6PFU/ kg~2X lO^FU/kg。與溶劑對(duì)照組相比，Ml病毒組顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0040] 本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，可用于治療多種腫瘤，包括肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、 乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明 Ml病毒引起多種腫瘤細(xì)胞的死亡；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Ml病毒在體內(nèi)顯著抑制肝癌、結(jié)直腸癌的 生長(zhǎng)；在人離體活腫瘤組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明Ml病毒顯著抑制肝癌、結(jié)直腸癌組織存活。
[0041] 本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，可優(yōu)先的治療ZAP低表達(dá)/ZAP陰性腫瘤，包括但不 限于肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽 癌、月市癌、胃癌。
[0042] 本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，具有選擇性抗腫瘤作用，安全性良好。Ml病毒能選擇 性引起腫瘤細(xì)胞死亡，而對(duì)正常細(xì)胞的存活無影響，表明Ml病毒具有腫瘤細(xì)胞選擇性；在 荷瘤裸鼠體內(nèi)，經(jīng)尾靜脈注射的Ml病毒能高度富集于腫瘤組織，而在正常組織內(nèi)病毒量較 低，二者病毒量相差約IO 2~IO6倍，進(jìn)一步闡明了 Ml病毒的腫瘤選擇性。同時(shí)給予Ml病 毒并不影響裸鼠體重和精神狀態(tài)，表明Ml病毒安全性良好。
[0043] 本發(fā)明首次針對(duì)特定的個(gè)體/腫瘤提供安全有效的病毒抗腫瘤藥物。本發(fā)明藥物 選擇性地治療ZAP低表達(dá)/ZAP陰性的腫瘤，由此提高了用藥有效率，防止無效給藥和藥物 濫用。
[0044] 本發(fā)明提供了更為有效的用藥方法和用藥系統(tǒng)，通過先檢測(cè)患者腫瘤的ZAP表達(dá) 水平，再針對(duì)性地給予藥物治療，或者輔以其他手段給予治療，可以提高M(jìn)l病毒的治療針 對(duì)性和有效性。
[0045] 本發(fā)明提供了更為有效的抗腫瘤藥物和腫瘤治療方法，在給藥前或給藥同時(shí)，輔 以ZAP抑制劑，從而可以提高了腫瘤對(duì)藥物的敏感性。
【附圖說明】
[0046] 圖IMl病毒顯著引起腫瘤細(xì)胞病變效應(yīng)；
[0047] a)Ml病毒感染引起腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)病變；
[0048] b) Ml病毒感染對(duì)正常細(xì)胞株形態(tài)學(xué)沒有影響，Control表示0ptiPR0?SFM培養(yǎng)基 對(duì)照組，Ml表示Ml病毒感染實(shí)驗(yàn)組。
[0049] 圖2M1病毒有效抑制荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)；
[0050] a)Ml病毒瘤內(nèi)注射后對(duì)H印3B荷瘤鼠腫瘤體積與動(dòng)物體重的影響，Ml表示Ml病 毒處理組，溶劑表示0ptiPR0?SFM培養(yǎng)基溶劑對(duì)照組，η = 9 ;
[0051] b)Ml病毒瘤內(nèi)注射后對(duì)LoVo荷瘤鼠腫瘤體積與動(dòng)物體重的影響，η = 11 ;
[0052] c)Ml病毒靜脈注射后對(duì)H印3Β荷瘤鼠腫瘤體積與動(dòng)物體重的影響，η = 9 ;
[0053] d) QRT-PCR檢測(cè)靜脈注射Ml病毒后在H印3Β荷瘤鼠的組織分布，η = 6 ;
[0054] 腫瘤體積與體重?cái)?shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，ANOVA法統(tǒng)計(jì)；箭頭表示Ml病毒處 理組，圓圈表示0ptiPR0?SFM培養(yǎng)基對(duì)照組，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；i. t表示瘤內(nèi)注射，i. V 表不靜脈注射；*表不未檢測(cè)到Ml病毒的mRNA表達(dá)。
[0055] 圖3M1病毒選擇性引起ZAP低表達(dá)/ZAP陰性腫瘤細(xì)胞死亡；
[0056] a) ZAP mRNA表達(dá)量在不同細(xì)胞中的差異表達(dá)；ND表示未檢測(cè)到ZAP的mRNA表達(dá)；
[0057] b)ZAP的蛋白表達(dá)量在不同細(xì)胞中的差異表達(dá)；β-actin是內(nèi)參；
[0058] c)細(xì)胞ZAP蛋白水平與Ml病毒感染引起的細(xì)胞存活率改變。β-actin是內(nèi)參， students' t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，林P〈0. 01 ;
[0059] d)Ml病毒顯著引起敲低ZAP水平后的正常細(xì)胞L