r>[0156] 典型地，提供了用于表達載體的表達的宿主細胞。細胞可以為哺乳動物、鳥類、昆 蟲、爬行動物、細菌、植物或真菌細胞。哺乳動物細胞的實例包括但不限于人、兔、雞、嚙齒動 物（例如，小鼠、大鼠）細胞。典型的哺乳動物細胞包括骨髓瘤細胞、Sp2/0細胞、CHO細胞、 L細胞、COS細胞、成纖維細胞、MDCK細胞、HT29細胞、HEK細胞、或T84細胞。優(yōu)選的宿主細 胞是CH0-K1?？墒褂脴藴始夹g(shù)將表達載體引入到宿主細胞，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、核顯微注射、 DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、細菌原生質(zhì)體融合和電穿孔。
[0157] 可通過以下方法制備多聚蛋白，包括：（1)制備包含編碼單體單元的核酸分子的 載體；（2)用載體轉(zhuǎn)染宿主細胞；（3)培養(yǎng)宿主細胞以提供表達；和（4)回收多聚蛋白。
[0158] 可回收多聚蛋白作為不同分子大小的產(chǎn)物。典型地，包含5個、6個或7個單體單 元的期望多聚蛋白占包括單體單元的全部蛋白的以重量計至少40%。適合地，它占包括單 體單元的全部蛋白的以重量計至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、或至少90 %?？?被回收作為期望的多聚蛋白的高比例的單體單元有助于生產(chǎn)效率。
[0159] 如果通過宿主細胞分泌多聚蛋白，它可方便地利用其對Fc結(jié)合劑，諸如蛋白A或 蛋白G、適合地蛋白G HiTrap (GE healthcare)柱的親和力通過親和色譜法來回收?？赏ㄟ^ 低PH從此類柱洗脫蛋白到中性緩沖液中。隨后可用緩沖液交換進行透析。如果宿主細胞 不分泌多聚蛋白，它可通過溶解細胞之后親和色譜法來回收。
[0160] 在以下實施例中將進一步詳述本發(fā)明，但對其無任何限制。
[0161] 實施例1 :重組多聚Fc蛋白的產(chǎn)生
[0162] 如以下制備了 DNA構(gòu)建體。市購可得的pFUSE_hIgGl_Fc2表達載體從InvivoGen 獲得，來源于Autogen Bioclear，Wiltshire, UK。表達載體包含來自IL2的信號序列的編碼 序列和其下游的來自人IgGl的Fc部分的編碼序列。為了產(chǎn)生多聚蛋白，對人IgGlFc部分 的編碼序列進行了兩處改變。將來自IgM的18個氨基酸尾片段亞克隆到Fc部分的C端， 并且在C γ 3結(jié)構(gòu)域中進行了另外突變以分別轉(zhuǎn)變309殘基和310殘基（從始到終為EU編 號）為半胱氨酸和亮氨酸。
[0163] 為了將IgM尾片段序列插入到市購可得的載體中，設(shè)計了當一起退火時將形成具 有編碼Nhel限制性位點的突出堿基的雙鏈序列的引物，以允許將C端亞克隆到Fc。為了維 持由質(zhì)粒編碼的蛋白的閱讀框，去除現(xiàn)有的終止密碼子，并且允許方便的限制位點，插入了 額外的DNA堿基。在IgM尾片段之前的是編碼四個氨基酸Leu-Val-Leu-Gly的短5'接頭； 接頭不影響IgM尾片段的功能。
[0164] 通過溫度梯度將引物1和引物2 (SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2) -起退火，以形成 包含Nhel插入物的雙鏈IgM尾片段。
[0165] 然后用限制酶Nhel消化pFUSE載體，并連接以上的IgM尾片段插入物以產(chǎn)生中間 質(zhì)粒。為了允許在Fc區(qū)之后翻譯IgM尾片段，利用Quick Change II試劑盒（Stratagene, La Jolla，CA, USA)通過定點誘變在后續(xù)步驟中突變存在的終止密碼子。設(shè)計了引物3和引物 4 (SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4)以去除此終止密碼子并在Fc區(qū)和IgM尾片段之間產(chǎn)生 AvrII限制酶位點。這產(chǎn)生了稱為pFUSE-hlgGl-Fc-TP的質(zhì)粒。
[0166] 在人IgM中，位置309的半胱氨酸參與五聚體中IgM的兩個單體之間形成二硫橋。 為了更好地模擬人IgM的蛋白序列，再次如以上地通過定向誘變設(shè)計了引物5和引物6 (SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6)以引入在位置309的半胱氨酸殘基。在編碼人IgM的蛋白序列的 核苷酸序列與人IgGl-Fc的比對之后，另外地，決定用中性亮氨酸殘基替換在位置310處的 鄰近組氨酸殘基。并入兩個突變的最終質(zhì)粒被命名為pFUSE-hIgGl-Fc-TP-LH309/310CL。
[0167] 還制備了編碼缺少309/310突變和尾片段的人IgGlFc的單體的對照質(zhì)粒。
[0168] 組裝為聚合體的單體單元的核酸編碼序列為SEQ ID No. 7。
[0169] 編碼序列具有以下區(qū)域：
[0170] 1 60 IL2信號肽的編碼序列 61-753 人丨gG丨的Fc區(qū)的編碼序列 325-330 cys-309 和 leu-3 10 突變 754-810 IgM尾片段的編碼序列（包括接頭區(qū)和終止密碼子)
[0171] 組裝為聚合體的單體單元的氨基酸序列為SEQ ID No. 8。
[0172] 氨基酸序列具有以下區(qū)域：
[0173] 1-20 IL2信號肽
[0174] 21-247 人丨gG丨的Fc區(qū) 109-110 cys-309 和 leu-310 突變 248-251 4個氨基酸的接頭 252-269 IgM 尾片段
[0175] 在表達期間，IL2信號肽被裂解且如此終蛋白產(chǎn)物具有249個氨基酸。
[0176] 如以下制備了多聚Fc蛋白和對照單體Fc蛋白。通過電穿孔用所選的質(zhì)粒和陽性 克隆轉(zhuǎn)染 CH0-K1 細胞（European Collection of Cell Cultures)。在 37°C/5% CO2 下， 將細胞生長于補充有10%超低（ultra-low)牛IgG FCS、100IU/ml青霉素、和IOOygmr1鏈 霉素（PAA)的DMEM完全培養(yǎng)基。在包含AooygmrlZeocin(Invivogen)的培養(yǎng)基中選擇了 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。通過使用山羊抗人IgG-Fc(Sigma-Aldrich:A0170)的夾心酶聯(lián)免疫吸附試 驗（ELISA)檢測了分泌Fc融合蛋白的克隆。在蛋白G-Sepharose (GEHealthcare, Little Chalfont，Bucks, UK)上從補充有包含超低IgG的FBS (Gibco)的DMEM中的大規(guī)模培養(yǎng)物純 化了 Fc融合蛋白。匯集來自親和純化的洗脫的級分并使用AKTAfi^ (GE Healthcare)在高效 Superdex-20010/300GL柱上通過體積排阻色譜法分離。將洗脫的級分與已知的高MW凝膠 過濾標準（Biorad)相比較。通過SDS-PAGE在天然6% Tris-甘氨酸凝膠上針對SeeBlue2 預(yù)染色分子量標志物（Novex-Invitrogen)驗證了蛋白的完整性。
[0177] 多聚蛋白表達為約312kD和約IOOkD的復(fù)合物，與作為六聚實體和二聚實體的表 達相一致。如在圖IB中圖示的，根據(jù)體積排阻色譜法，比例為約90%六聚體對10%二聚體 (w/w)O
[0178] 實施例2 :重組多聚Fe蛋白的結(jié)構(gòu)特征
[0179] 通過在溶液中輕敲模式原子力顯微術(shù)（AFM)使六聚Fe成像。六聚Fe形成了良 好界定的結(jié)構(gòu)的高度均勻群體。獲得的AFM圖像顯示復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上是圓柱形（直徑 18±2nm(n = 51)，高度5. 7±0· 4nm(n = 54))。在圖IA中顯示了代表性圖像。獲得的圖像 還與從計算機模擬建模分析預(yù)測的尺寸一致，也在圖IA中圖示。
[0180] 如下且如在Mekhaiel等，2011a中描述的進行了 AFM。以0. 2xHBSS緩沖液將在 IxHBSS緩沖液中的hIgGl-Fc-LH309/310CL-TP儲備溶液稀釋到10 μ gml-1且然后直接應(yīng)用 到白云母的新鮮切割段。在孵育20分鐘之后，用0. 2xHBSS緩沖液徹底沖洗樣品以去除未 吸附的分子。在運輸至AFM以及在AFM中成像期間樣品總在溶液中。用Nanoscope IIIa Multimode AFM(Veeco, Santa Barbara, CA)在 0· 5xHBSS緩沖液中使用具有 0· 32N/m 的彈性 常數(shù)的氮化娃懸臂（NP-S, Veeco Probes, Santa Barbara, CA)以輕敲模式進行成像。典型 掃描率和最初振蕩幅度分別為3Hz和20nm，且將應(yīng)用的力最小化到約0.1 nN。使用云母和 黃金標線校準壓電式掃描儀（9 μ m, D scanner, Veeco)。所有報道的圖像在不同的尖端和不 同快速掃描方向是可再現(xiàn)的。所有側(cè)向尺寸從在半高處的全寬確定。
[0181] 如下且如描述于Mekhaiel等，2011a中的進行分子（計算機模擬）建模。使用 鉸鏈區(qū)和尾片段區(qū)兩者的隨機鏈結(jié)構(gòu)，從hIgGIFc結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)中構(gòu)建了單體。在 組裝為六聚體復(fù)合物之前，使每個單體能量最小化。使用VMD/NAMD使用CHARMM27力場進 行所有能量計算。NAMD由在伊利諾伊大學(xué)厄本那-香檳分校（University of Illinois at Urbana-Champaign)的貝克曼高等科技研宄所（Beckman Institute for Advanced Science and Technology)中的倫理生物物理小組（Theoretical Biophysics Group)開 發(fā)。為了構(gòu)建六聚體，考慮了兩個實驗性觀察結(jié)果：首先，復(fù)合物的化學(xué)計量是有限的（即， 寡聚不會無限地進行），以及第二，寡聚需要Cys309突變。前一觀察結(jié)果表明，存在一些阻 止進一步組裝的物理原因，我們論述將其歸因于復(fù)合物為環(huán)形，類似于以天然IgM復(fù)合物 所觀察到的那些。后一觀察結(jié)果表明，峨鄰單體通過這些C309殘基連接。為了這些連接 可能在環(huán)形復(fù)合物中，這些殘基必須全部在共同平面之內(nèi)，如在IgM五聚體中同源半胱氨 酸殘基的情況。關(guān)于這些Fc融合物，存在可滿足這些標準的兩種類型的寡聚物：星形，其 中C309平面與Fc平面相同；和桶形，其中C309平面與Fc平面垂直。經(jīng)過一個另外的標 準，檢查了兩種模型以確定哪種模型產(chǎn)生具有更低能量的結(jié)構(gòu)。由于這些Fc融合物沒有進 化為彼此相互作用而是借助于突變的C309殘基連接，我們假定單體不經(jīng)過顯著結(jié)構(gòu)變化 而形成這些鍵，且因此對任何此類變化分配了能量罰分。這通過將骨架原子束縛在位于能 量最小化的單體結(jié)構(gòu)的位置的中心的諧波孔內(nèi)（彈性常數(shù)，lkcal/mol/A2)來實現(xiàn)。通 過監(jiān)測此束縛電位對總的最小化的能量的貢獻，可評價每個單體從單體形式改變構(gòu)象的程 度。在沒有此束縛的情況下，在最初C309-C309距離的范圍下評價的星形和桶形結(jié)構(gòu)，將具 有相似的最小化能量。然而在具有束縛的情況下，明顯的是，在全部距離中，桶形結(jié)構(gòu)比星 形模型需要顯著更少的結(jié)構(gòu)變化以形成C309-C309二硫橋。因此，在沒有此束縛的情況下， 桶形結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了與星形結(jié)構(gòu)相似的最小化的能量，然而需要到單體形式的更少變化。因此， 我們偏向桶形結(jié)構(gòu)用于六聚體。最終模型構(gòu)建于最接近最初C309-C309間隔，在此處存在 到單體結(jié)構(gòu)的最小程度的結(jié)構(gòu)變化。進行這些計算而沒有任何尾片段連接到其他單體。如 通過蛋白骨架的均方根偏差（root-mean-squared-deviation)判斷的，在此最小化的模型 中，尾片段連接到復(fù)合物內(nèi)的其他隨機選擇的單體，且然后用TIP3水使整個復(fù)合物成溶劑 化物、最小化并最終平衡。
[0182] 實施例3 :多聚Fc蛋白與免疫系統(tǒng)的組分的相互作用
[0183] 1.與Fc受體的相互作用
[0184] 六聚體Fc與全部測試的Fc受體，即人Fc γ RI、Fc γ RIIA與Fc γ RIIB、以及小鼠 Fc γ RI與Fc γ RIIB結(jié)合。與以微摩爾范圍與相同受體結(jié)合的二聚體或單體相比，六聚體Fc 以更高親和力（在納摩爾范圍內(nèi)）與低親和力人Fcy R(Fcy RIIAk131和Fcy RIIB)結(jié)合。這 確認了，更高等級聚合體事實上具有對已知參與保護免受ITP的受體改善的結(jié)合動力學(xué)。 在5?1?分析中，六聚體？(3以1.61101°的以（1/^)與人？〇丫1?1結(jié)合。二聚體以6.4110 9的 KA(1/M)結(jié)合。在圖2中顯示了通過ELISA，六聚體或單體Fc與Fc受體的結(jié)合。
[0185] 可在ITP中起作用的另一個受體為Fcy RIII (Park-Min等，2007)?？梢灶A(yù)計六 聚體Fc與人Fcy RIII結(jié)合，因為Fcy RIII在IgG上的結(jié)合位點與FcyRIIB和FcyRI 的結(jié)合位點重疊（Sondermann等，2001)。IgG較低鉸鏈區(qū)在與Fc γ RI和Fc γ RII的相互 作用中起了關(guān)鍵作用，且所有Fc γ R共享共同的與IgG相互作用的模式看起來是可能的 (Woof 和 Burton, 2004)。事實上，基于 Fc γ RIII -IgG Fc 晶體結(jié)構(gòu)，在 IgG Fc 與 Fc γ RI 以及Fcy RII之間產(chǎn)生模式復(fù)合物是可能的，并從而使特定結(jié)合特征合理化（Sondermann 等，2001)。使用Fc γ RIII的晶體結(jié)構(gòu)對Fc γ RIII和六聚體Fc復(fù)合物的相互作用進行計 算機模擬建模。模型顯示，在針對FcyRIII的六聚體中的結(jié)合位點是最有可能暴露的，如 同對于其他Fc γ R明顯的。因此，我們預(yù)測Fc γ RIII將與六聚體Fc結(jié)合。
[0186] 通過如下面并在Mekhaiel等，2011a中描述的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)確定了 Fc蛋白與Fc受體的結(jié)合。用滴定量的PBS或碳酸鹽緩沖液pH 9中Fc蛋白（50-0. 3nM)包 被微量滴定孔（Nunc)并在4°C孵育過夜，隨后在室溫（RT)下用4%脫脂牛奶（Acumedia) 封閉1小時。用PBS/0. 005 %吐溫20 (PBS/T) pH 7. 4洗滌孔4次，隨后添加在4 %脫脂牛 奶卩85/0.005%吐溫20(?85/1'4!17.4中稀釋的651'或!115-融合的1^。丫1?1、1^。丫1?11八、 hFc γ RIIB、mFc γ RI或mFc γ RIIB并添加到孔。在室溫下孵育2小時并如上洗滌之后，添加 來自山羊的HRP綴合的多克隆抗GST (1:8000 ;GEHealthcare)并在室溫下孵育1小時。如上 洗滌孔，將100 μ 1底物TMB (Calbiochem)添加到每個孔并孵育45分鐘，隨后添加100 μ 1的 0.25Μ HCl。使用 Sunrise TECAN 分光光度計（TECAN, Maennedorf, Switzerland)在 450nm 下測量吸光度。
[0187] 如以下關(guān)于FcRn確切描述的，還通過表面等離子體共振分析分析了與人Fc γ RI 的結(jié)合。
[0188] 2.與已知在控制自身免疫中起作用的聚糖受體的相互作用
[0189] 人DC-SIGN和其在小鼠中的同源物（SIGN-Rl)已經(jīng)證明通過結(jié)合發(fā)現(xiàn)于附著在 IgG的Fc的Ν297上的聚糖上的末端唾液酸來參與控制ITP (Anthony等，2011 ;Samuelsson 等，2001)。如下證明了六聚體Fe蛋白的唾液酸化。如前所述，還原的蛋白在4-12 % Bis-Tris凝膠上運行并轉(zhuǎn)移到PVDF膜并用1 % Roche封閉劑封閉（Samuelsson等，2001)。 然后，將用1/200稀釋的生物素化的接骨木樹皮凝集素 （Sambucus nigra bark lectin) (Vector Laboratories)孵育膜，并用鏈霉親和素 -HRP (Serotec)顯影。計算機模擬建模預(yù) 測，發(fā)現(xiàn)于六聚體Fe蛋白的這些末端唾液酸將可用于結(jié)合DC-SIGN或SIGN-Rl (圖1)。
[0190] 3.與新描述的可在控制自身免疫性疾病中起作用的受體的相互作用
[0191] 人B細胞抑制性受體在控制自身免疫性疾病中是重要的（Pritchard和 Smith, 2003)。已經(jīng)描述了在人B細胞表面上的IgG的兩種抑制性受體：Fe γ RIIb (Daeron 等，1995)和較新的FcRL5 (Wilson等，2012)。盡管在人B細胞中FcRL5相對Fe γ RIIb冗 余是可能的，通過Fe γ RIIb和SHP-I同時募集SHIP-I到FcRL5的潛力提供了反復(fù)活化B細 胞的實質(zhì)性障礙。有趣地，在天然B細胞上的FcRL5也被痘病毒MHC I類樣immunoevasin 所靶向，說明FcRL5在調(diào)節(jié)免疫中的重要作用（Campbell等，2010)。FcRL5僅結(jié)合復(fù)合的 IgG并且不結(jié)合單體IgG且因此IVIG將不太可能以高的總親和力結(jié)合此受體，盡管IVIG的 多聚級分可以以高的總親和力結(jié)合?？傊?，F(xiàn)e γ RIIb和FcRL5可限制針對慢性病原體或自 反應(yīng)抗原的B細胞活化，且具有靶向兩種受體的潛力的方法可證明在旨在控制B細胞活化 的治療中是有益的。
[0192] 因此，我們調(diào)查了六聚體IgGl-Fc與人⑶19+B細胞的結(jié)合（圖3)。作為評價六 聚體IgGl-Fc與參與控制自身免疫的免疫細胞的相互作用的第一步，我們通過FACS分析調(diào) 查了六聚體IgGl-Fc結(jié)合人B細胞的能力。我們證明了，六聚體IgGl-Fc與從健康人志愿 者的外周循環(huán)中純化的CD19+B細胞結(jié)合。如在Mekhaiel等，2011a中描述的進行了流式 細胞術(shù)。按照制造商的說明書通過Polymorphprep梯度離心從全血中純化了人白細胞。在 室溫下用200 μ 1包含50 μ g的六-Fe的FAC緩沖液（磷酸鹽緩沖鹽水、0. 2%牛血清白蛋 白、5%山羊血清）或僅用緩沖液孵育IxlO5細胞1小時。用FAC緩沖液洗滌細胞兩次并在 4°C下用在200 μ1 FAC緩沖液中1/500稀釋的F(ab'）2山羊抗hlgG-Fc-藻紅蛋白（PE)和 山羊抗hO)19焚光素異硫氰酸鹽（FITC)綴合的Ab (Southern Biotechnology)孵育1小 時。用FAC緩沖液洗滌之后，在FACScan (BD Biosciences)上分析細胞。用CELLQuest軟 件（BD Biosciences)進行數(shù)據(jù)采集并用FlowJo 9.1版進行分析。考慮到CD19+B淋巴細 胞前向和側(cè)向散射圖對它們進行了門控，并用PE標記的二抗監(jiān)測了 Fc蛋白的結(jié)合。在缺 少Fc蛋白的情況下沒有檢測到PE-標記的二抗的結(jié)合。通過用特異性阻斷FcRL5的單克 隆抗體509F6在先孵育細胞證明了六聚體Fc結(jié)合人B細胞表面上的FcRL5,所述特異性阻 斷FcRL5的單克隆抗體509F6使六聚體Fc蛋白的結(jié)合脫落。
[0193] 4.與新生FcRn的結(jié)合
[0194] 我們調(diào)查了六聚體Fc與負責(zé)維持Ab在循環(huán)中的長半衰期的新生FcRn相互作用 的能力（Mekhaiel等，2011a)。盡管FcRn在ITP中沒有起顯著的作用，它可在六聚體Fc介 導(dǎo)的更多種慢性自身免疫性疾病的控制中起作用，其中長半衰期對于治療是重要的。盡管 六聚體Fc不能與人FcRn結(jié)合，它事實上與以前的觀察相一致地以nM親和力與小鼠 FcRn結(jié) 合（pH6下0. 1-lOnM) (Andersen等，2010)。這表明，對現(xiàn)有構(gòu)建體的較小修改，例如Leu310 回復(fù)為His310,可使與人FcRn的結(jié)合恢復(fù)。
[0195] 通過表面等離子體共振分析并如以下以及在Mekhaiel等，2011a中所述的確定了 Fc蛋白與FcRn的結(jié)合。使用Biacore 3000儀器（GE Healthcare)進行了表面等離子體 共振（SPR)分析。使用如在由制造商提供的方案中描述的胺偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)將CM5傳感器芯 片的流動小室與重組形式的可溶性人或小鼠 FcRnQiFcRn或mFcRn ;約2200-3000RU)相偶 聯(lián)。通過注射IOmM醋酸鈉 pH 5.0 (GE healthcare)中2 ygmr1蛋白進行了偶聯(lián)。使用pH 6. O下磷酸鹽緩沖液（67mM磷酸鹽緩沖液、0. 15M NaCl、0. 005 %吐溫20)或HBS-EP緩沖液 (0.0 lM HEPES、0. 15M NaCl、3mM EDTA、0. 005%表面活性劑P20)作為運行緩沖液和稀釋緩 沖液。用25°C下20 μ Ι/min的流速，在pH 6. 0或pH 7. 4下將IOOnM的每種Fc融合蛋白注 射到固定化受體上。使用pH 7. 4下的注射HBS-EP緩沖液（GE Healthcare)進行了表面的 再生。在全部實驗中，將數(shù)據(jù)調(diào)零且減去了參考小室。使用BIAevaluation 4.1軟件（GE Healthcare)評價了數(shù)據(jù)。
[0196] 5.與補體的結(jié)合
[0197] 至今研宄的大多數(shù)Fc