異甘草素及衍生物的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及異甘草素及其衍生物的新用途，具體涉及異甘草素及衍生物抗腫瘤以 及與抗腫瘤藥物合用增敏、減少耐藥性方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 異甘草素為一種黃酮類化合物，廣泛存在于豆科植物中。現(xiàn)代藥理研究表明，異甘 草素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、治療心血管病等用途。
[0003] 近年有抗腫瘤的治療研究發(fā)現(xiàn)異甘草素具有抗腫瘤的活性，但對其與化療藥物共 用的增敏、減少耐藥等效果未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的在于提供異甘草素及其衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；
[0005] 本發(fā)明的第二個目的在于提供異甘草素及其衍生物在制備作為化療藥的增效劑 或減少化療藥耐藥性藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種抗腫瘤的藥物組合物。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的在于提供一種抗腫瘤的藥劑盒。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 異甘草素及其衍生物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用；
[0010] 進(jìn)一步，其特征在于在抑制腫瘤細(xì)胞增殖；
[0011] 進(jìn)一步，其特征在于在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；
[0012] 進(jìn)一步，所述腫瘤為乳腺腫瘤/肝臟腫瘤等腫瘤。
[0013] 異甘草素及其衍生物在制備作為化療藥的增效劑或減少化療藥耐藥性藥物中的 應(yīng)用。
[0014] 從理論上講，包含異甘草素的天然植物均具有抗腫瘤和與化療藥物協(xié)同增效、減 低抗藥性的作用；此外由天然植物經(jīng)常規(guī)提取得到的提取物同樣具有上述作用。其中，所述 包含異甘草素的天然植物如豆科植物雞血藤、甘草、黃芪、紅芪等；所述提取物為水/乙醇 提取物，或水/乙醇提取物經(jīng)進(jìn)一步分離純化得到的提取物。
[0015] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種抗腫瘤的藥物組合物，該組合物由作為活性成分的異 甘草素或其衍生物及化療藥物組成，其劑量為臨床所接受的常規(guī)劑量。
[0016] 進(jìn)一步，所述異甘草素的日用劑量為2mg/kg- 100mg/kg。
[0017] 本發(fā)明組合物可按照常規(guī)工藝加入常規(guī)輔料制成藥劑學(xué)可接受的任何制劑，如茶 齊IJ、膠囊劑、片劑、顆粒劑、凝膠劑、緩釋劑、口服液、滴丸劑或納米制劑；也可與其他相關(guān)藥 物配伍使用，制成相應(yīng)的制劑。所述藥學(xué)可接受的輔料包括：填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸 齊IJ、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露 醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉 鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括：硬脂 酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、 蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維 素等。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤的藥劑盒，該藥劑盒由異甘草素或其衍生物和化療藥 物組成，其中活性成分的重量比例為（5~150) :(0. 5~3)。
[0019] 進(jìn)一步，活性成分的重量比為5:1. 5 - 50:1. 5。
[0020] 進(jìn)一步，所述異甘草素的日用劑量為2mg/kg- 100mg/kg。
[0021] 本發(fā)明所述化療藥為臨床常用的化療藥物，包括紫杉醇，多西他賽，長春新堿，門 冬酰胺，阿糖胞苷，環(huán)磷酰胺，比柔比星，氟尿嘧啶，硫嘌呤，阿霉素等。
[0022] 本發(fā)明所述異甘草素可以從市場購買，也可以從豆科植物雞血藤、甘草中提取或 其它植物中提取得到，還可以從其他植物中分離純化得到，也可以通過化學(xué)合成或生物合 成方法得到，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0023]
[0024] 異甘草素
[0025] 本發(fā)明所述異甘草素衍生物為與異甘草素具有相同黃酮母核的化合物，本發(fā)明研 究發(fā)現(xiàn)異甘草素衍生物同樣具有抗腫瘤、及與化療藥物協(xié)同增效、減低抗藥性的用途。
[0026] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述異甘草素衍生物為新異甘草素，結(jié)構(gòu)如下：
[0027]
[0028] 新異甘草素
[0029] 本發(fā)明研究表明，異甘草素及其衍生物以及包含異甘草素及其衍生物的均能夠顯 著抑制腫瘤細(xì)胞增殖及克隆，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；其與化療藥物聯(lián)用能夠?qū)崿F(xiàn)增敏、減少耐 藥性的目的。
【附圖說明】
[0030] 圖1異甘草素對癌細(xì)胞的長期增殖抑制作用
[0031] 圖2異甘草素腫瘤細(xì)胞珠蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
[0032] 圖3異甘草素對腫瘤組織LDH-A，HIF-Ia和Ki67的影響
[0033] 圖4A異甘草素對正常組織(心肝脾肺腎）的影響
[0034] 圖4B異甘草素對心臟和肌肉形態(tài)及其中LDH的表達(dá)
[0035] 實(shí)驗(yàn)例1異甘草素（ISL)對腫瘤細(xì)胞增殖及克隆形成的抑制作用
[0036] I.MTT法檢測異甘草素對腫瘤細(xì)胞增殖的影響
[0037] I. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0038] 分別取乳腺腫瘤細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7,乳腺正常細(xì)胞株MCF-10A，肝腫瘤細(xì) 胞株7703、H印G2,肝正常細(xì)胞株L02,以3XIOVml的細(xì)胞濃度加至96孔板，180iil/孔。配 制各濃度異甘草素，使其終質(zhì)量濃度分別為〇, 10, 20, 30,40, 50uM，每一濃度設(shè)5個平行孔。 同時設(shè)立對照孔（只含等體積細(xì)胞懸液，不加藥物），空白調(diào)零孔（只含等體積完全培養(yǎng)基， 不加藥物）分別培養(yǎng)24、48和72h以觀時效。于每孔加10ill新配制的MTT溶液（IOmg/ ml)，培養(yǎng)箱中孵育4h;棄培養(yǎng)基，每孔加150iiLDMSO振蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶 標(biāo)儀在490nm處測定吸光值（0Dvalue)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取平均值。
[0039] 1. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-2。
[0041] 表1異甘草素對腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響
[0042]
[0043]
[0044] 表2異甘草素對正常細(xì)胞增殖作用的影響
[0045]
[0046] 結(jié)果顯示異甘草素（ISL)能明顯抑制乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖， 且具有明顯量效與時效的關(guān)系。但對乳腺正常細(xì)胞MCF-10A則不具有上述特點(diǎn)。同時，異 甘草素（ISL)同樣具有抗肝腫瘤細(xì)胞H印G2和7703的作用，但對肝的正常組織細(xì)胞L02抑 制作用很小，類似于對MCF-10A增殖作用。
[0047] 2.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測異甘草素對癌細(xì)胞生存、克隆形成的影響
[0048] 2. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0049] 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、MCF-7、7703、IfepG2單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0? 25%胰蛋白 酶消化并吹打成單個細(xì)胞，以每孔200個細(xì)胞的細(xì)胞濃度接種于六孔板中，兩周后計(jì)數(shù)克 隆數(shù)目，細(xì)胞數(shù)大于30為一個克隆。終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加1:3 醋酸/甲醇固定15分鐘。加適量Giemsa染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染 色液，空氣干燥。
[0050] 2. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0051] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。
[0052] 結(jié)果表明異甘草素（ISL)處理后細(xì)胞與對照組比較積落數(shù)明顯減少，說明異甘草 素（ISL)有顯著的影響乳癌及肝癌的細(xì)胞集落形成能力，即異甘草素（ISL)能抑制乳癌及 肝癌的生存能力，并具有量效依賴的關(guān)系，而對正常的細(xì)胞則不具有明顯的抑制作用。
[0053] 實(shí)驗(yàn)例2異甘草素（ISL)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用
[0054] 1異甘草素對腫瘤細(xì)胞周期的影響
[0055] I. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0056] 將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231，MCF-7,IfepG2和7703細(xì)胞，按每孔2X105個細(xì) 胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁過夜后加入異甘草素使終濃度為25uM和50uM，于37°C 作用24h。胰酶消化收集細(xì)胞，4°ClOOOr/min離心5min，棄上清液；用預(yù)冷的PBS重懸細(xì) 胞，4°C1000r/min離心5min，棄上清液；加入預(yù)冷的PBS300ul和預(yù)冷的無水乙醇700ul，迅 速潤旋混勻；將該細(xì)胞懸液置于4°C固定過夜；第2天,4°C1000r/min離心5min,棄上清液； 加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞lml, 3000r/min離心5min,棄上清液；向細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷的 PBSO. 5ml和Rnase(終濃度10ug/ml)lul，渦旋混勻后，于37°C水浴15min;最后，加入碘化 丙啶(終濃度20ug/ml)2. 5ml，室溫避光染色30min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量，每 組樣品分析IX104個細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用CellQuest軟件分析。
[0057] 1. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0058] 通過細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，加入異甘草素可顯著抑制乳腺癌及肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期 進(jìn)程，使G2/M期阻滯。
[0059] 2異甘草素對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響
[0060] 2. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0061] 將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231，MCF-7,IfepG2和7703細(xì)胞，按每孔2X105個細(xì) 胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁過夜后加入異甘草素使終濃度為25uM和50uM，于37°C 作用24h。胰酶消化收集細(xì)胞，4°C1000r/min離心5min，棄上清液；預(yù)冷的PBS洗2次，細(xì) 胞重懸于冷的結(jié)合緩沖液。然后每0. 5毫升結(jié)合緩沖液加入AnnexinFITC染色溶液和溴 化丙啶（PI)染色溶液各5ul，室溫避光孵育lOmin。用流式細(xì)胞儀檢測。
[0062] 2. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0063] 結(jié)果顯示異甘草素能顯著提高乳腺癌及肝癌細(xì)胞的凋亡，結(jié)果也提示了誘導(dǎo)癌細(xì) 胞凋亡可能是異甘草素抗腫瘤作用中的重要機(jī)制。
[0064] 實(shí)驗(yàn)例3異甘草素（ISL)對化療增敏的體內(nèi)外研究
[0065] 1異甘草素（ISL)對化療增敏的體外研究 [0066]I. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0067]MIT法檢測：分別取MDA-MB-231、MDA-MB-231、MCF-7、MCF-7/ADR(乳癌阿霉素耐 藥株)，以3X103/ml的細(xì)胞濃度加至96孔板，180iil/孔。配制各濃度異甘草素和化療藥 物，每一濃度設(shè)5個平行孔。同時設(shè)立對照孔（只含等體積細(xì)胞懸液，不加藥物），空白調(diào)零 孔（只含等體積完全培養(yǎng)基，不加藥物）分別培養(yǎng)24h。于每孔加10iU新配制的MTT溶 液（lOmg/ml)，培養(yǎng)箱中孵育4h;棄培養(yǎng)基，每孔加150iiLDMSO振蕩5min，使結(jié)晶物充分 溶解，用酶標(biāo)儀在490nm處測定吸光值（0D值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取平均值。
[0068] 蛋白提取及免疫印跡檢測：細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度的異甘草素處理，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后收集細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞蛋白。利用BCA法