測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品30ug進(jìn)行 SDSPAGE凝膠電泳(分離膠10%，濃縮膠5% )，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（100V，2h)，5%脫脂牛 奶室溫封閉2 h，加入一抗4°C孵育過(guò)夜，加入二抗（1:1000)孵育I h，洗膜后，經(jīng)過(guò)顯、定 影得到目的蛋白表達(dá)變化條帶。
[0069] 1. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0070] 異甘草素分別與紫杉醇、阿霉素、5-Fu聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)表3;異甘草 素單獨(dú)及與阿霉素聯(lián)用耐藥株MCF-7/ADR的抑制作用見(jiàn)表4-5;蛋白提取及免疫印跡檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0071] 表3異甘草素分別與紫杉醇、阿霉素、5-Fu聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用
[0072]
[0073]
[0074] 表3結(jié)果表明，異甘草素能分別協(xié)同化療藥物紫杉醇，阿霉素和氟尿嘧啶抑制乳 癌及肝癌細(xì)胞的增殖，其中干細(xì)胞富集細(xì)胞系乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231效果最顯著。由此 可見(jiàn)異甘草素（ISL)與化療藥物合用的增效作用主要是針對(duì)腫瘤干細(xì)胞。
[0075] 表4阿霉素對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞株MCF-7和耐藥株MCF-7/ADR的抑制作用
[0076]

[0080] 表4-5結(jié)果表明，異甘草素（ISL)能顯著抑制耐藥性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR的 增殖，并協(xié)同化療藥物阿霉素誘導(dǎo)其凋亡。
[0081] 圖2結(jié)果表明，異甘草素（ISL)能抑制耐藥性相關(guān)蛋白ABCG2的表達(dá)，且具有量效 依賴關(guān)系，異甘草素（ISL)能誘導(dǎo)MCF-7/ADR通過(guò)線體途徑凋亡，且具有量效依賴關(guān)系。
[0082] 2異甘草素（ISL)對(duì)化療增敏的體內(nèi)研究
[0083] 2. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0084] 動(dòng)物分組：用乳癌（MDA-MB-231)及肝癌（7703)細(xì)胞株培養(yǎng)后，用PBS懸浮至1~ 3X106/0.Iml/鼠，i.p接種于乳腺處。待成瘤成功，將裸鼠分為5組，每組6只。分別為空 白對(duì)照組，化療藥物阿霉素組，異甘草素低劑量組，異甘草素高劑量組，阿霉素-異甘草素 協(xié)同組。劑量：化療藥物阿霉素為I. 5mg/kg/week，低劑量異甘草素為25mg/kg/day，高劑量 異甘草素為50mg/kg/day，阿霉素-異甘草素協(xié)同組為阿霉素I. 5mg/kg/week加上異甘草素 50mg/kg/day。阿霉素腹腔注射，一周一次。異甘草素以灌胃方式每天一次。
[0085] 腫瘤體積測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將所有小鼠脫頸處死，取腫瘤組織，計(jì)算腫瘤體積。
[0086] 免疫組化檢測(cè)：切取瘤組織用4%多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟 包埋切片?？乖迯?fù)，加一抗過(guò)夜。第二天DAB顯色，蘇木紫對(duì)比染核。觀察LDH-A(乳酸 脫氫酶-A)，HIF-Ia(缺氧誘導(dǎo)因子-Ia)和Ki67表達(dá)的變化。
[0087] 瘤體組織的TUNEL分析：切片按常規(guī)脫蠟和脫水，加IOiig/ml的蛋白酶K后在 37°C中孵育30min，按照RocheAppliedScience公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操 作步驟進(jìn)行，光鏡下觀察，高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)及凋亡細(xì) 胞。
[0088] 2. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0089] 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積結(jié)果見(jiàn)表6-7。
[0090] 表6異甘草素及其與阿霉素聯(lián)用對(duì)MDA-MB-231體積的影響
[0091]
[0094]
[0095]表6-7結(jié)果表明，異甘草素（ISL)能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)并有明顯的量效依賴關(guān) 系，抑制率分別為44. 36% (低劑量組)和67. 92% (高劑量組)。同時(shí)，異甘草素（ISL)能增加 化療藥物阿霉素對(duì)抗腫瘤的增敏作用，其對(duì)乳腺有效抑制率達(dá)89. 37%，結(jié)果暗示異甘草素 (ISL)能促進(jìn)化療藥物的化療增敏。同樣，異甘草素（ISL)也能抑制7703細(xì)胞所致的移植 性肝癌.
[0096] 免疫組化分析結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明異甘草素（ISL)處理后的腫瘤組織中其 LDH-A，HIF-Ia和Ki67的表達(dá)都降低。用TUNLE分析發(fā)現(xiàn)其凋亡率增加。
[0097] 實(shí)驗(yàn)例4異甘草素（ISL)對(duì)正常組織的副作用觀察
[0098] 用H&E染色考察重要臟器的形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示異甘草素對(duì)小鼠體內(nèi)正常組 織(心肝脾肺腎）在最大有效劑量?jī)?nèi)無(wú)病理毒害作用（見(jiàn)圖4A)，且免疫組化結(jié)果表明異甘 草素在最大有效劑量?jī)?nèi)對(duì)心臟和肌肉形態(tài)及其中LDH的表達(dá)無(wú)影響（見(jiàn)圖4B)。
[0099] 實(shí)驗(yàn)例5異甘草素衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響
[0100] 新異甘草素（NISL)是在異甘草素的基礎(chǔ)上加多了一個(gè)糖，其活性較異甘草素會(huì)增 強(qiáng)，我們用新異甘草素與LDHA(乳酸脫氫酶A)進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合的穩(wěn)定性好，明顯 的優(yōu)于異甘草素。下述細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，也證明其具有較好抗腫瘤，增敏，減少耐藥性的效 果。
[0101] 1實(shí)驗(yàn)方法（同實(shí)驗(yàn)例I"1、MTT法檢測(cè)異甘草素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響"）
[0102] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0103] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8-9。
[0104] 表8新異甘草素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響
[0105]
[0109] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新異甘草素（NISL)處理后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，新異甘草素 (NISL)能抑制乳癌及肝癌的生存能力，并具有量效依賴的關(guān)系，而對(duì)正常的細(xì)胞則不具有 明顯的抑制作用。
[0110] 實(shí)驗(yàn)例6新異甘草素（NISL)對(duì)化療增敏的體內(nèi)外研究
[0111] 1新異甘草素（NISL)對(duì)化療增敏的體外研究
[0112] I. 1實(shí)驗(yàn)方法（同實(shí)驗(yàn)例3 "1、異甘草素對(duì)化療增敏的體內(nèi)外研究MTT法檢測(cè)"）
[0113] 1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0114] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10-12。
[0115] 表10新異甘草素分別與紫杉醇、阿霉素、5-Fu聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用
[0116]
[0117]
[0118] 結(jié)果顯示，新異甘草素對(duì)不同的化療及不同的腫瘤細(xì)胞株都具有增敏作用，且具 有量效依賴的關(guān)系。
[0119] 表11新異甘草素及與阿霉素聯(lián)用耐藥株MCF-7/ADR的抑制作用
[0123] 結(jié)果表明，新異甘草素(NISL)能顯著抑制耐藥性乳腺癌細(xì)胞系的MCF-7/ADR的增殖。
[0124] 2新異甘草素（NISL)對(duì)化療增敏的體內(nèi)研究
[0125] 2. 1實(shí)驗(yàn)方法（同實(shí)驗(yàn)例3 "2、異甘草素（ISL)對(duì)化療增敏的體內(nèi)研究"）
[0126] 2. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0127] 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積結(jié)果見(jiàn)表13。
[0128] 表13新異甘草素及其與阿霉素聯(lián)用對(duì)MDA-MB-231體積的影響
[0129]
[0130]
[0131] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新異甘草素能顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)并有明顯的量效依賴關(guān)系， 抑制率分別為68. 08% (低劑量組）和77. 06% (高劑量組)。同時(shí).新異甘草素能增加化療 藥物阿霉素對(duì)抗腫瘤的增敏作用，其對(duì)乳腺有效抑制率達(dá)93. 77%，結(jié)果顯示新異甘草素能 促進(jìn)化療藥物的化療增敏。與異甘草素比較，其結(jié)果新異甘草素優(yōu)于異甘草素。
【具體實(shí)施方式】
[0132] 實(shí)施例1
[0133] 原料：異甘草素50mg，紫杉醇I. 5mg
[0134] 制備方法：按比例取原料藥，按常規(guī)制劑工藝制備成片劑。
[0135] 實(shí)施例2
[0136] 原料：異甘草素40mg，阿霉素3mg
[0137] 制備方法：按比例取原料藥，按常規(guī)制劑工藝制備成膠囊劑。
[0138] 實(shí)施例3
[0139] 原料：異甘草素60mg，5-氟尿啼陡0. 5mg
[0140] 制備方法：按比例取原料藥，按常規(guī)制劑工藝制備成注射劑。
[0141] 實(shí)施例4
[0142] 原料：新異甘草素45mg，阿霉素2mg
[0143] 制備方法：按比例取原料藥，按常規(guī)制劑工藝制備成膠囊劑。
[0144] 實(shí)施例5
[0145] 原料：新異甘草素55mg，紫杉醇Img
[0146] 制備方法：按比例取原料藥，按常規(guī)制劑工藝制備成片劑粉針劑。
[0147] 實(shí)施例6
[0148] 原料：異甘草素50mg，阿霉素I. 5mg
[0149] 制成藥劑盒，每個(gè)藥劑盒含異甘草素、阿霉素各一瓶。異甘草素和阿霉素分別口服 和靜脈注射，每日一次。
[0150] 實(shí)施例7
[0151] 原料：異甘草素50mg，紫杉醇2mg
[0152] 制成藥劑盒，每個(gè)藥劑盒含異甘草素、紫杉醇各一瓶。異甘草素和紫杉醇分別口服 和靜脈注射，每日一次。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 異甘草素及其衍生物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療中腫瘤是治療乳腺癌、肝癌或其它 腫瘤。3. 異甘草素及其衍生物作為化療藥的增效劑或減少化療藥物耐藥性藥物中的應(yīng)用，其 中所述化療藥物為紫杉醇，多西他賽，長(zhǎng)春新堿，門(mén)冬酰胺，阿糖胞苷，環(huán)磷酰胺，比柔比星， 氟尿嘧啶，硫嘌呤，阿霉素的任一種。4. 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述異甘草素衍生物為新異甘草 素。5. -種抗腫瘤的藥物組合物，該組合物由作為活性成分的異甘草素或其衍生物及化療 藥物組成，其劑量為臨床可接受常規(guī)劑量；化療藥物為紫杉醇，多西他賽，長(zhǎng)春新堿，門(mén)冬酰 胺，阿糖胞苷，環(huán)磷酰胺，比柔比星，氟尿嘧陡，硫嘌呤，阿霉素的任一種。6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，異甘草素的日用劑量為2mg/kg-IOOmg/ kg。7. 如權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述異甘草素衍生物為新異甘 草素。8. -種抗腫瘤的藥劑盒，該藥劑盒由異甘草素或其衍生物和化療藥物組成，其中活性 成分的重量比例為（5~150) : (0. 5~3)，所述化療藥物為紫杉醇，多西他賽，長(zhǎng)春新堿，門(mén) 冬酰胺，阿糖胞苷，環(huán)磷酰胺，比柔比星，氟尿嘧陡，硫嘌呤，阿霉素的任一種。9. 如權(quán)利要求8所述的藥劑盒，其特征在于，其中所述異甘草素的日用劑量為2mg/ kg- 100mg/kg。10. 如權(quán)利要求8-9任一所述的藥劑盒，其特征在于，所述異甘草素衍生物為新異甘草 素。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種異甘草素及其衍生物的新用途，特別是提供一種異甘草素、新異甘草素、包含異甘草素及其衍生物的天然植物或其提取物抗腫瘤以及作為化療藥的增效劑或減少化療藥耐藥性藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】A61P35/00, A61K31/7034, A61K31/12
【公開(kāi)號(hào)】CN104887650
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410074036
【發(fā)明人】陳建萍, 王志宇, 王能
【申請(qǐng)人】陳建萍
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2014年3月3日