，米勒-亨頓肉 湯（Mueller-HintonBrooth,MHB)為培養(yǎng)基。取化合物樣品及抗生素諾氟沙星各適量，以 DMSO溶解配置成一定濃度的兩種母液，以肉湯稀釋。不加藥物作為陰性對(duì)照。接種細(xì)菌96 孔板于37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，加入MTT，觀察結(jié)果，以細(xì)菌完全不生長(zhǎng)時(shí)所需藥 物的最低濃度為藥物對(duì)此菌種的MIC值，以MTT溶液3-[4, 5-二甲基噻唑基-2]-2, 5-二苯 基四唑藍(lán)溴化物（Sigma)，用于檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)，MTT由黃色變成藍(lán)色則指示有細(xì)菌生長(zhǎng)；
[0026] 所采用的細(xì)菌株為EMRSA-16,為一種耐諾氟沙星金黃葡萄球菌。
[0027] 2.協(xié)同作用試驗(yàn)表明所述化合物對(duì)抗生素的增效作用，
[0028] 本發(fā)明在96孔板上以二倍稀釋法形成的不同濃度進(jìn)行化合物與抗生素協(xié)同作用 抗菌試驗(yàn)：
[0029] 取適量諾氟沙星溶于DMSO配成抗生素母液，取適量諾氟沙星母液溶于肉湯中配 成諾氟沙星原液，取化合物樣品適量溶于DMSO配成母液，用肉湯稀釋，化合物和抗生素起 始抑制濃度分別為128和256yg/mL，以此進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，記錄每行細(xì)菌不生長(zhǎng)的微孔所對(duì) 應(yīng)的諾氟沙星的濃度是與化合物樣品聯(lián)用時(shí)諾氟沙星的MIC值。
[0030] 實(shí)驗(yàn)中，化合物1 -5在最高起始濃度128iig/mL時(shí)，MTT由黃色變成藍(lán)色并產(chǎn)生微 粒狀沉淀，指示有細(xì)菌生長(zhǎng)，即不具有抗菌活性；但與諾氟沙星共同給藥，化合物與抗生素 共同存在使不長(zhǎng)細(xì)菌的微孔數(shù)目增加，觀察對(duì)應(yīng)的微孔中抗生素的使用濃度，顯示化合物 的存在使抗生素最低抑菌濃度分別降低4 - 64倍，表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同抗耐藥菌作用（如表1 所示)。
[0031]表1、萘醌二聚體對(duì)氟諾沙星的抗耐藥金葡菌EMRSA-16的增效作用
[0033] 結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物可與諾氟沙星制備組合藥物，產(chǎn)生降低諾氟沙星的最低 抑菌濃度以及對(duì)諾氟沙星產(chǎn)生抗耐藥金葡菌具有增效作用，進(jìn)一步可制成抗菌注射劑，外 用藥物制劑。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中，采用的儀器和實(shí)驗(yàn)材料為：
[0035]紅外光譜儀：Avatar?360E. S. P.?,ThermoNicoletCorporation;
[0036] 核磁共振儀：VarianMercuryPlus400MHz超導(dǎo)核磁共振波譜 儀，CDCl3, DMSO, Acetone ;
[0037]質(zhì)譜：EI-MS:Agilent5973NMSD型質(zhì)譜儀；
[0038]旋光：PolarimeterP-1020, JASCOCorporation;
[0039] 層析硅膠：煙臺(tái)市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠；青島海洋化工廠分廠；
[0040] 硅膠H (60型）：10~40 iim,青島海洋化工廠分廠；
[0041] TCL板，煙臺(tái)市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠；
[0042] 反相硅膠：C-18,Fluka公司；
[0043] 諾氟沙星及MTT購(gòu)于西格瑪公司（SigmaChemicalCo. Ltd.);
[0044]米勒-亨頓肉湯（Mueller-HintonBrooth, MHB)購(gòu)于Oxoid公司。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 取新疆紫草（Arnebiaeuchroma)(購(gòu)于藥材公司）的根1千克，粉碎,95%乙醇45攝 氏度以下浸泡提取，合并提取液減壓濃縮至乙醇全部揮發(fā)完畢，加水至浸膏混懸，用乙酸乙 酯萃取，有機(jī)相減壓蒸干后用硅膠和RP-18正反相柱層析多次分離得到紫色固體化合物， 其中，化合物2和3的核磁共振譜數(shù)據(jù)如表2所示。
[0047] 表2、化合物2和3的核磁共振譜數(shù)據(jù)
[0048]
O
[0049] 實(shí)施例2、對(duì)金黃葡萄球菌EMRSA-16化合物對(duì)抗生素的協(xié)同抗菌增效作用
[0050] 在96孔板上以二倍稀釋法形成的不同濃度進(jìn)行化合物與抗生素協(xié)同作用抗菌試 驗(yàn)。
[0051] 取適量諾氟沙星溶于DMSO配成抗生素母液，取適量諾氟沙星母液溶于肉湯中配 成諾氟沙星原液，取化合物樣品適量溶于DMSO配成母液，用肉湯稀釋，化合物和抗生素起 始抑制濃度分別為128和256yg/mL，以此進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，記錄每行恰好細(xì)菌不生長(zhǎng)的微孔 所對(duì)應(yīng)的諾氟沙星的濃度是與化合物樣品聯(lián)用時(shí)諾氟沙星的MIC值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0052] 實(shí)施例3、化合物對(duì)金黃葡萄球菌的直接抗菌作用
[0053]取標(biāo)準(zhǔn)金葡菌株ATCC25922,耐藥菌株SA1199B、RN4220、EMRSA-15 和Xu212 進(jìn)行 微孔抑菌實(shí)驗(yàn)。在96孔板上以二倍稀釋法形成的不同濃度進(jìn)行化合物與抗生素協(xié)同作用 抗菌試驗(yàn)。取適量諾氟沙星溶于DMSO配成抗生素母液，取適量諾氟沙星母液溶于肉湯中配 成諾氟沙星原液。取化合物樣品適量溶于DMSO配成母液。用肉湯稀釋，諾氟沙星為對(duì)照藥 物，化合物對(duì)所試菌株的最低抑制濃度均大于128yg/mL。化合物單獨(dú)用藥時(shí)均未顯示出抑 制細(xì)菌生長(zhǎng)活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 萘醌二聚體化合物，其特征在于，構(gòu)成化合物的單元為一個(gè)去氧紫草素與一個(gè)具有 紫草萘醌類化合物紫草素（Alkanin和Shikonin)及其衍生物，通過萘環(huán)之間結(jié)合形成二聚 體結(jié)構(gòu)；2. 權(quán)利要求1的萘醌二聚體化合物在制備抗菌藥物中的用途；所述化合物以單體或混 合物形式用于抗菌藥物的制備。3. 權(quán)利要求1的萘醌二聚體化合物在制備抗菌藥物增效劑中的用途；所述的化合物抗 生素諾氟沙星共同給藥時(shí)，使抗生素最低抑菌濃度至少降低4倍。4. 權(quán)利要求1的萘醌二聚體化合物在制備抗菌藥物增效劑中的用途；所述的化合物抗 生素諾氟沙星共同給藥時(shí)，使抗生素的抑菌濃度降低為單獨(dú)用藥的64分之一。5. 按權(quán)利要求，2或3或4的用途，其特征在于，所述化合物本身沒有抑制細(xì)菌生長(zhǎng) 作用，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和生存不具有壓迫作用；所述化合物在正常試驗(yàn)濃度范圍128 μ g/ mL(200yM)內(nèi)不抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。6. 按權(quán)利要求，2或3或4的用途，其特征在于，所述化合物逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)退幗鹌暇鷮?duì)諾 氟沙星的耐藥，其中，諾氟沙星單獨(dú)給藥時(shí)，最低抑菌濃度為256 μ g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及天然萘醌二聚體及其在制備抗菌藥物中的用途。所述萘醌二聚體類化合物其本身沒有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)作用，但與抗生素諾氟沙星共同給藥時(shí)，具有顯著的協(xié)同抗耐藥菌作用，使得抗生素最低抑菌濃度至少降低4倍；優(yōu)選使抗生素的抑菌濃度降低為單獨(dú)用藥的64分之一；所述化合物對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)退幗鹌暇鷮?duì)諾氟沙星的耐藥表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)作用，可能以單體或混合物形式作為藥物增效劑，與氟喹諾酮類抗生素制備抗耐藥細(xì)菌藥物。
【IPC分類】A61P31/04, A61K31/222, A61K31/122, A61K31/496
【公開號(hào)】CN104887677
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410078971
【發(fā)明人】穆青, 葉佳, 孫仲琳, 西蒙.吉本斯, 穆合蘇爾.熱合曼
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2014年3月5日