調(diào)素啟動子活性的誘導(dǎo)超過70% (圖2G，柱4)。
[0141] 由于DRAGON. Fc在體內(nèi)對鐵調(diào)素表達和鐵代謝沒有作用，盡管與HJV. Fc相比其在 體外作為BMP-2和BMP-4的抑制劑具有較高的效力，同時與HJV. Fc相比，DRAGON. Fc在抑 制BMP-6方面不太有效，因此BMP-6可能是鐵調(diào)素表達和鐵代謝的重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)物。測 試了在小鼠中特異性中和BMP-6的抗體的施用是否影響鐵調(diào)素表達和鐵代謝。如圖3A中 所示，中和BMP-6的抗體選擇性地抑制Hep3B細胞中BMP-6對鐵調(diào)素啟動子熒光素酶報告 分子的活化，但對BMP-2、BMP-4、BMP-5或BMP-9沒有顯著的作用。BMP-6抗體在較高濃度 下顯示針對BMP-7的一些抑制性活性，但與BMP-6相比顯著較?。▓D3A)。如圖3B中所示， 與假處理的對照小鼠相比，如通過定量實時RT-PCR測量，用BMP-6抗體處理三天的小鼠的 肝臟鐵調(diào)素表達顯著地減少約50%。另外，與假處理的對照相比，BMP-6抗體處理的小鼠具 有顯著增加的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度（圖3C和D)。
[0142] 通過在8周齡Bmp6敲除小鼠（Bmp6null mice)中測試，確認內(nèi)源性BMP-6在調(diào) 節(jié)鐵調(diào)素表達和鐵代謝中的重要性，Bmp6敲除小鼠以前由Solloway等（Solloway MJ,等 1998. Dev Genet. 22:321-39)產(chǎn)生。這些Bmp6敲除小鼠被描述為在發(fā)育期間在骨骼形成 方面有些中度遲緩，但與野生型對照小鼠相比沒有其他明顯的缺陷，如通過定量實時RTPCR 測量，Bmp6敲除小鼠顯示肝臟鐵調(diào)素表達減少大約10倍（圖4A)，并且如通過Western印 跡測量，脾膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達增加2.3倍（圖4B和C)。另外，Bmp6敲除小鼠具有顯著增 加的血清鐵，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度接近100% (圖4D和E)。與野生型對照相比，在Bmp6敲 除小鼠中肝臟鐵含量增加超過20倍（圖4F和H)，而脾鐵含量減少4倍（圖4G)。在8周 齡Bmp6敲除小鼠的肝臟中鐵過載程度似乎與報道的類似年齡的Hfe2-I小鼠中的程度相當 (Huang, F. W.，等 J. Clin. Invest. 115:2187-2191 ;Niederkofler，V.，Salie，R.，Arber，S. 2 005. J Clin Invest. 115:2180-6)。因此，Bmp6敲除小鼠具有類似于由于BMP共同受體血 幼素的喪失引起的青少年血色素沉著病的表型。
[0143] 下一步，測試外源性BMP-6在體內(nèi)調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達和鐵代謝的能力。小鼠以250和 1000 yg/kg IP注射以單劑量的外源性BMP-6配體。如通過定量實時RT-PCR測量，BMP-6 施用顯著地增加肝臟鐵調(diào)素表達。BMP-6施用還導(dǎo)致血清鐵（圖5B)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和 度（圖5C)的劑量依賴性減小。
[0144] 這些結(jié)果證明外源性BMP-6施用在體內(nèi)正面調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達并且減少血清鐵，而 Bmp6基因的敲除或使用BMP-6抗體選擇性抑制內(nèi)源性BMP-6抑制鐵調(diào)素表達、增加血清鐵、 并且最終導(dǎo)致類似于由于BMP共同受體Hf e2中的突變引起的遺傳性血色素沉著病的表型。 這些數(shù)據(jù)支持了 BMP-6作為鐵調(diào)素表達的主要內(nèi)源性調(diào)節(jié)物的重要性。
[0145] 大量BMP配體已經(jīng)顯示在體外調(diào)節(jié)鐵調(diào)素，包括BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、 BMP-7 和 BMP-9(Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939 ;Wang，R.H·，等 2005. Cell Metab. 2:399-409 ;Truksa，J·，等 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:10289-10293)。除 BMP-7 以外的所有這些配體的信使 RNA在人肝臟中內(nèi)源性地表達（Xia Y，等2008. Blood. 1115195-204)。盡管以前已經(jīng)顯示， 血幼素直接結(jié)合 BMP-2 和 BMP-4 配體（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539)，血 幼素的可溶性形式HJV. Fc抑制BMP-6對鐵調(diào)素活性的活化，甚至比其抑制BMP-2和BMP-4 活性的能力更有效（Babitt，J.L·，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939)。另外，siRNA 或中和抗體對內(nèi)源性BMP-6的抑制作用抑制了血幼素介導(dǎo)的對鐵調(diào)素表達的誘導(dǎo)（Xia Y， 等2008. Blood. 1115195-204)。這些數(shù)據(jù)表明BMP-6是血幼素的配體。
[0146] 對于BMP-6在鐵代謝中的作用的更多支持證據(jù)來自最近的一項研宄，該研宄報 道Bmp6轉(zhuǎn)錄物響應(yīng)于富鐵飲食而增加，并且響應(yīng)于貧鐵飲食而減少（Kautz，L，等2008. Blood. 112:1503-9)。在該研宄中Bmp2轉(zhuǎn)錄物在極端鐵過載的條件下輕微上調(diào)并且Bmp4 沒有變化（同前）。盡管血幼素結(jié)合BMP-2和BMP-4兩者，但在我們的研宄中選擇性抑制 BMP-2和BMP-4的DRAGON. Fc不能抑制鐵調(diào)素表達和調(diào)控全身鐵平衡，表明BMP-2和BMP-4 配體在此背景下可能是不太重要的。本發(fā)明人進行的測試也沒有發(fā)現(xiàn)在Bmp6敲除小鼠的 肝臟中Bmp2和Bmp4轉(zhuǎn)錄物水平有任何變化，盡管存在明顯的鐵過載（數(shù)據(jù)未顯示）。然 而，數(shù)據(jù)并沒有明確地排除其他BMP配體（包括BMP-2和BMP-4)在鐵代謝中的任何可能的 作用。
[0147] 數(shù)據(jù)清楚地表明選擇性BMP-6抑制劑可能是用于治療由于鐵調(diào)素過量引起的炎 癥性貧血的有效藥劑。Bmp6敲除小鼠中缺少任何其他明顯的表型表明更有選擇性的抑制 劑可以被較好的耐受且存在較少的脫祀（off-target)效應(yīng)。另外，BMP-6樣激動劑可能是 在當前療法難以治療的患者中處理鐵過載失調(diào)的可替代治療策略。盡管還沒有記載帶有 BMP-6突變的人類患者，但數(shù)據(jù)也表明BMP-6突變或BMP-6基因變體可以作為遺傳性血色素 沉著病的另一病因或疾病外顯率的調(diào)節(jié)劑起作用。
[0148] 無需進一步詳細說明，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用前面的描述以其最充分的程 度利用本發(fā)明。下面的實施例僅是說明性的，并且不以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部 分。
[0149] 實施例
[0150] 實施例LcDNA的制備
[0151] 由 GenScript Corporation (Piscataway, NJ 08854)基于預(yù)測的 GPI 銷上游的人 DRAGON 蛋白序列（UniProtKB/Swiss-Prot 登記號 Q6NW40,氨基酸 1-409)和人 IgGlFc 序 列（來自 Signal pig plus 載體（R&D Systems)和 GenBank AF150959)生成 cDNA 編碼密 碼子優(yōu)化的DRAGON. Fc0
[0152] 實施例2. DRAGON. Fe和HJV. Fe的制備和純化
[0153] 根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書，使用293fectin(Invitrogen)將cDNA編碼的DRAGON. Fe 轉(zhuǎn)染進 Freestyle 293-F 細胞（Invitrogen)中。轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)在 GIBCO Freestyle 293表達培養(yǎng)基（Invitrogen)中，以IlORPM在增濕的8 % CO2培養(yǎng)箱中在37 °C下振 搖。轉(zhuǎn)染后7天，細胞通過離心而沉淀，并且如中Babbitt, J. L，等2005. J. Biol. Chem. 280:29820-29827所述，從培養(yǎng)基中經(jīng)一步蛋白A親合色譜法，使用Hi-Trap rProtein A FF 柱（Amersham Biosciences)純化 DRAGON. Fc。如 Babitt, J.L·，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9中所述制備HJV.Fc。為了測定純度和定量蛋白濃度，將DRAGON. Fe和HJV. Fe進行還原性SDS-PAGE，接著進行Bio-safe考馬斯藍染色（Bio-Rad)以及使用 抗 HJV 抗體（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539)、抗 DRAGON 抗體（Samad, ΤΑ. ， 等 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036) 、 和 羊抗人 Fc 抗體 （Jackson ImmunoResearch Laboratories)如所述的那樣進行 Western 印跡。（Babitt, J. L.，等 2006.似1:· Genet. 38:531-539 ;Samad, T. A.，等 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036)。蛋白濃度還通過牛 血清白蛋白蛋白測定（Pierce)進行定量。
[0154] 實施例3. BMP-6的制備
[0155] 純化的重組人BMP-6如以前所述進行制備（Simic，P.，等2006. J Biol Chem. 281:25509-21)。凍干的BMP-6溶解在20mM乙酸鈉、5%甘露醇溶液，pH 4. 0中用于 動物注射。
[0156] 實施例4.熒光素酶測定
[0157] 使用雙重焚光素酶報告分子測定系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay System) (Promega)如以前所述（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt，J. L.，等2007. J Clin Invest. 117:1933-9)采用下列的改進方案在肝細胞瘤來源的H印3B 細胞中進行鐵調(diào)素啟動子熒光素酶報告分子測定。用鐵調(diào)素啟動子熒光素酶報告分子 (Babitt, J. L，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539)和對照 Renilla 熒光素酶載體（pRL-TK) 轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞在補充了 1 % FBS的含有L-谷氨酰胺（Invitrogen)的a-MEM中進行 血清饑餓培養(yǎng)6小時，接著用25ng/mL BMP-2(由哈佛牙科醫(yī)學(xué)院（Harvard School of Dental Medicine)的 Vicki Rosen 饋贈）、BMP-4、BMP-6 或 BMP-7, 50ng/mL BMP-5 或 5ng/ mL BMP-9 (R&D Systems)單獨或與 0· 2-25 μ g/mL DRAGON. Fe、HJV. Fe 或抗 BMP-6 抗體一起 刺激16小時。選擇相對濃度的BMP配體來引起類似程度的鐵調(diào)素啟動子熒光素酶活性，如 以前所述的那樣（Babitt，J.L·，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9)。
[0158] 實施例5.動物
[0159] 所有動物實驗方案均由位于馬薩諸塞州總醫(yī)院的機構(gòu)內(nèi)動物照護和使用委員 會（Institutional Animal Care and Use Committee)和位于薩格勒布大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (University of Zagreb School of Medicine)處的機構(gòu)內(nèi)動物照護和使用委員會和 科技部批準。8周齡129S6/SvEvTac小鼠（Taconic)圈養(yǎng)在馬薩諸塞州總醫(yī)院嚙齒動 物設(shè)施中并以含有380ppm鐵的Prolab5P75Isopro RMH 3000膳食飼養(yǎng)。由Elizabeth J. Robertson饋贈的具有混雜129Sv/C57背景的Bmp6敲除小鼠 （Solloway MJ,等1998. Dev Genet. 22:321-39)圈養(yǎng)在薩格勒布大學(xué)醫(yī)學(xué)院（University of Zagreb School of Medicine)處并且以含有 180mg/kg 鐵的標準 GLP 膳食（4RF21，Mucedola, Italy)飼養(yǎng)。
[0160] 對于 DRAGON. Fe 和 HJV. Fe 實驗，8 周齡 129S6/SvEvTac 小鼠（Taconic)接受腹膜 內(nèi)注射5或10mg/kg劑量的DRAGON. Fc，5或7mg/kg劑量的HJV. Fc，或等體積的等滲鹽水每 周3次持續(xù)3周。對于BMP-6抗體注射實驗，8周齡129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜內(nèi)注射 lOmg/kg單克隆抗人BMP-6抗體（R&D Systems)或等滲鹽水每天一次持續(xù)3天。最后一次 注射后12小時，將小鼠處死并采集血液和肝臟用于測量鐵參數(shù)和鐵調(diào)素表達。
[0161] 對于BMP-6注射實驗，8周齡129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜內(nèi)注射250或1000 mcg/ kg的BMP-6或僅等體積的載體（20mM乙酸鈉，5%甘露醇溶液，pH 4. 0)。注射后6小時，將 小鼠處死并采集血液、肝臟和脾用于測量鐵參數(shù)和鐵調(diào)素表達。
[0162] 對于Bmp6敲除小鼠實驗，5只8周齡Bmp6敲除小鼠和5只野生型對照小鼠被處死 并采集血液、肝臟和脾用于測量鐵參數(shù)和鐵調(diào)素表達。
[0163] 實施例6.定量實時RT-PCR.
[0164] 使用RNeasy試劑盒（QIAGEN)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書從小鼠肝臟中分離總 RNA。如以前所述使用2步定量實時RT-PCR進行Hampl mRNA轉(zhuǎn)錄物相對于RPL19的實 時定量（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9 ;Xia，Y·，等 2007. J Biol Chem. 282:18129-40)。也使用以前描述的引 物對來自Bmp6敲除小鼠的肝臟的Bmp2、Bmp4和Bmp6mRNA相對于野生型小鼠進行實時定量 (Kautz, L.，等 2008. Blood. 112:1503-9) 〇
[0165] 實施例 7. Western 印跡·
[0166] 對于膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白測定，如以前所述制備脾膜制劑。蛋白濃度通過BCA測定 (Pierce)確定。在室溫下在lx Laemmli緩沖液中溶解30分鐘后，每個樣品20 μ g蛋白使 用預(yù)制的 NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝膠（Invitrogen)通過 SDS-PAGE 解析并轉(zhuǎn)移至 HWF膜上（液體轉(zhuǎn)移法）。印跡用處于含有0. 1 % Tween的tris緩沖鹽水（TBS) (TBS-T) 中的10%脫脂乳飽和并用2. 5 μ g/ml膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白抗體（稀釋在含有5%脫脂乳的TBS-T 中）在4°C探測過夜。Knutson，M.D·，等 2005.Proc Natl Acad Sci USA. 102:1324-8。在 用TBS-T洗滌后，印跡與1:5000稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG(Sigma)溫育1小時。 使用增強化學(xué)發(fā)光ECLB法（Perkin Elmer)進行檢測。剝離印跡并且如Babitt, J.L.,等 2006. Nat. Genet. 38:531-539中所述重新探測作為內(nèi)參照（loading control)的β-肌動 蛋白表達?；瘜W(xué)發(fā)光使用IPLab光譜軟件3. 9. 5r2版（Scanalytics)進行定量。
[0167] 實施例8.血清和組織鐵測量.
[0168] 采集血清并如以前所述分析鐵濃度和不飽和鐵結(jié)合力。如以前所述計算總鐵結(jié) 合力和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。如以前所述對肝臟和脾組織進行非血紅素鐵的定量測量（參見 Babitt, J.L.,等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9) 〇
[0169] 實施例9.組織學(xué)
[0170] 來自Bmp6敲除小鼠和野生型小鼠的肝臟固定在2%多聚甲醛中，然后固定在2% 乙醇中，并包埋在石蠟中。5pm切片在二甲苯中脫蠟并在蒸餾水中水化。然后將切片在室 溫下在含有等體積的2%亞鐵氛化鉀（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)和 2%鹽酸的染色溶液中放置60min。然后切片在蒸餾水中漂洗，在0.2%番紅精（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)中復(fù)染2min,并在1%乙酸中洗絳，然后在95%乙醇、 無水乙醇中脫水，在二甲苯中澄清，并在DPX中封片（mount)。
[0171] 實施例10.統(tǒng)計學(xué).
[0172] 以P〈0. 05,采用學(xué)生雙尾t檢驗來確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。
[0173] 實施例11. DRAGON. Fc選擇性抑制BMP對鐵調(diào)素表達的誘導(dǎo).
[0174] 圖I. H印3B細胞用鐵調(diào)素啟動子熒光素酶報告分子和對照Renilla熒光素酶載體 (pRL-TK)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，如顯示的那樣，細胞在缺少或存在BMP-2、BMP-4、BMP-5、 BMP-6、BMP-7 或 BMP-9 配體的條件下，單獨或與 0. 2-25 μ g/mL 純化的 DRAGON. Fe (Dra. Fe) 或HJV. Fe -起溫育16小時。測定細胞溶胞產(chǎn)物的熒光素酶活性，并且相對熒光素酶活性 計算為螢火蟲與Renilla熒光素酶的比率以控制轉(zhuǎn)染效率。對于用BMP配體結(jié)合DRAGON. Fe或HJV. Fe處理的細胞與用BMP配體單獨處理的細胞相比較，結(jié)果報告為相對熒光素酶活 性的減少百分比的平均數(shù)+/_標準差，每組η = 2-4。顯示確切P-值。（lA)DRAGON. Fe對 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 和 BMP-9 配體的作用。（1B-1D) ·顯示 DRAGON. Fe 和 HJV. Fe 抑制 BMP-2 (IB)、BMP-4 (1C)和 BMP-6 (ID)的頭對頭比較（Head to head comparison)。
[0175] 實施例12.在小鼠中施用DRAGON. Fe不影響鐵調(diào)素表達或鐵代謝.
[0176] 圖2. 8周齡雄性129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜內(nèi)注射5(n = 3)或10mg/kg(n = 4) 的純化的可溶性DRAGON. Fe (Dra. Fe)或等體積的等滲鹽水（Con, η = 7)每周3次持續(xù)3 周。作為陽性對照，另一組小鼠接受腹膜內(nèi)注射5(η = 3)或7mg/kg(n = 4)的等量HJV. Fe 或等體積的等滲鹽水（Con，η = 7)每周3次持續(xù)3周。兩種DRAGON. Fe和HJV. Fe劑量的 結(jié)果是相似的，并且因此合并成一組。（A)分離總肝臟RNA，并且通過定量實時RT-PCR相對 于作為內(nèi)部對照的RPL19mRNA分析鐵調(diào)素 mRNA。（B)通過Western印跡對脾膜制劑分析膜 鐵轉(zhuǎn)運蛋白（FPN)表達。剝離印跡并且用作為內(nèi)參照的抗β-肌動蛋白抗體探測。對于膜 鐵轉(zhuǎn)運蛋白相對于β-肌動蛋白的表達，化學(xué)發(fā)光通過通過IPLab光譜軟件定量。（C和D) 血清鐵（C)和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度⑶的測量。（Ε和F)肝臟（E)和脾（F)組織鐵含量的定量。 (G)如圖1中那樣，Hep3B細胞用鐵調(diào)素啟動子熒光素酶報告分子和pRL-TK轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后 48小時，細胞在缺少或存在Ing/mL BMP-2的條件下，單