包含非天然吸濕性氨基酸的皮膚組合物的制作方法
【專利說明】包含非天然吸濕性氨基酸的皮膚組合物
[0001] 本申請涉及適于增強皮膚的水化和增濕的物質(zhì)和組合物。
[0002] 干燥?。╔erosis)，或干性皮膚，是大部分人在其一生中的某個點經(jīng)歷的常見病 癥。季節(jié)性的干燥病在寒冷干燥的冬季月份中常見，并且證據(jù)表明干燥病隨年齡變得更流 行（Whit-Chu, 2011)。多種炎性皮膚病癥，如特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis)、刺激性接 觸性皮炎（irritant contact dermatitis)和銀肩?。╬soriasis)，引起局部面積的干燥性 皮膚。另外，一些患者具有遺傳性病癥，如魚鱗病（ichthyosis)，導致慢性干性皮膚。
[0003] 天然保濕因子（NMF)的重要作用是維持充分的皮膚水化。角質(zhì)層的充分水化起到 三個主要作用：（1)其保持皮膚的可塑性，防止其受損傷；(2)其允許水解酶在脫皮過程中 起作用（Rawlings, 1994)，以及（3)其有助于最適宜的角質(zhì)層屏障功能。
[0004] NMF主要由游離氨基酸和這些氨基酸的多種衍生物組成，所述衍生物如羧酸吡咯 烷酮鈉（焦谷氨酸鹽，2-氧代-吡咯烷酮羧酸，或PCA)，尿刊酸（天然的紫外[UV]光吸收 劑），無機鹽，糖，和乳酸以及脲（表2) (Clar，1981)。目前與NMF相關(guān)的無機鹽包括氯化 物、磷酸鹽以及鈉、鉀、鈣和鎂的檸檬酸鹽。NMF包裝在角質(zhì)細胞（corneocytes)中，占角質(zhì) 細胞質(zhì)的約10%和角質(zhì)層干重的20%至30%。
[0005] NMF成分是高度有效的濕潤劑，其吸收并結(jié)合來自大氣或來自較深皮膚層的水分， 將水分汲取到角質(zhì)細胞中。這一過程甚至可以在相對濕度低至50%時發(fā)生，允許角質(zhì)細胞 在低濕度環(huán)境中保持充足的水分水平。水分的吸收是如此有效的，以致NMF基本上溶解在 其所吸收的水中（Rawlings,1994)。水化的NMF，特別是中性和堿性的氨基酸，形成與角蛋 白纖維的離子相互作用，減少纖維之間的分子間力，并且由此增加角質(zhì)層的彈性。這種彈性 起作用使得皮膚看起來健康柔軟，并且有助于防止由機械應(yīng)力引起的開裂或剝落。另外， NMF允許角質(zhì)細胞平衡由圍繞其的細胞內(nèi)"水泥（cement) "施加的滲透壓。
[0006] 保持溶質(zhì)濃度平衡對于防止大量水分注入（如在長時間洗浴后在發(fā)皺的皮膚中 觀察到的）和水分流出（其將引起角質(zhì)細胞收縮）二者。
[0007] 傳統(tǒng)上，認為角質(zhì)層不是活的組織。盡管這在技術(shù)上是真實的，但角質(zhì)層是一種動 態(tài)結(jié)構(gòu)，其中多種酶仍然起作用，并且這些酶需要特定量的游離的或液態(tài)的水來發(fā)揮作用。 結(jié)合NMF的水提供大量的這種必需水，并且這些酶中的多種參與脫皮過程，破壞在皮膚的 大部分表層中將角質(zhì)細胞保持在一起的多種鍵和力。研宄表明這些脫皮酶的活性受組織內(nèi) 水分水平的影響（Harding, 2000)。
[0008] NMF減少或缺少NMF已經(jīng)與多種角質(zhì)層異常相關(guān)，所述角質(zhì)層異常在臨床上表現(xiàn) 為具有起皮、剝落或者甚至皸裂和開裂的干性皮膚區(qū)域。這些病癥包括特應(yīng)性皮炎、銀肩 病、尋常性魚鱗?。╥chthyosis vulgaris)和干燥病。在特應(yīng)性皮炎中，已經(jīng)證明皮膚中 NMF的量通常減少（Palmer, 2006)，而在銀肩病皮膚和魚鱗?。╥chthyosis)中，NMF基本上 不存在（Harding，2000)。在更常見的皮膚病癥，如干燥病中，也觀察到減少的NMF水平。已 經(jīng)表明常規(guī)的肥皂清洗皮膚從角質(zhì)層的表層去除NMF。事實上，最外層典型地表現(xiàn)出減少 的NMF水平，這主要是由于洗浴或暴露于UV光。另外，衰老似乎急劇減少角質(zhì)層中的氨基 酸含量。研宄已表明皮膚水化與其氨基酸含量之間的顯著相關(guān)性（Horri，1989)。所有這些 病癥表現(xiàn)出異常的脫皮特征，角質(zhì)細胞積聚，導致干性皮膚明顯的干燥、粗糙、起皮和剝落 性質(zhì)（Harding, 2000)。
[0009] NMF的來源是大量時間的深入研宄的主題。關(guān)于尿刊酸和PCA的大量研宄確定這 些化合物來源于如上文所述被假定不包含活性酶的角質(zhì)層中的氨基酸。作為該研宄的結(jié) 果，現(xiàn)在認識到，盡管角質(zhì)層在生物學上是死亡的，但是其在生物化學上非常有活性。分析 角質(zhì)層的氨基酸組成最終導致這樣的發(fā)現(xiàn)：NMF成分是由聚絲蛋白蛋白水解產(chǎn)生的分解產(chǎn) 物（Scott,1982)。
[0010] 聚絲蛋白是一種位于新形成的角質(zhì)細胞中的存在于顆粒層上方的角質(zhì)細胞層中 的大的富含組氨酸的蛋白。聚絲蛋白的功能是聚集纖絲，并且具體地是將表皮的和毛根內(nèi) 鞘角蛋白纖絲排列成高度有序的線性陣列或粗原纖維。
[0011] 聚絲蛋白具有一種高分子量前體，即聚絲蛋白原，其源于顆粒層的透明角質(zhì)顆粒。 當粒細胞分化成角質(zhì)化細胞時，聚絲蛋白原去磷酸化并且降解成高堿性、低分子量的聚絲 蛋白。正是在這一階段聚絲蛋白起作用聚集纖絲，催化角蛋白纖維之間的二硫鍵形成。這 些聚集的纖維形成包繞進入角質(zhì)層的細胞的包膜的一部分，允許其保持角質(zhì)細胞特有的極 扁平的形狀（Scott, 1982)。
[0012] 一旦角蛋白纖維已經(jīng)形成，聚絲蛋白經(jīng)受幾乎是立即的蛋白水解和降解攻擊。該 降解過程中最初的步驟之一是聚絲蛋白精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基。該過程增加聚絲蛋 白分子的酸性，導致聚絲蛋白/角蛋白復合物的松懈，并且增加蛋白水解酶的接入。在這一 點上，聚絲蛋白分子完全降解成其各自的氨基酸和衍生物，這將占角質(zhì)層中存在的游離氨 基酸及其衍生物的70-100% (Scott, 1982)。
[0013] 隨著角質(zhì)細胞向角質(zhì)層的更表層移動，發(fā)生聚絲蛋白向NMF的轉(zhuǎn)化。聚絲蛋白加 工的時間和在角質(zhì)層中的準確深度取決于角質(zhì)細胞內(nèi)的水活性和外部的相對濕度。在潮濕 的環(huán)境中，當沒有干燥作用時，聚絲蛋白的水解幾乎在最外面的表面發(fā)生。在低濕度中，水 解在較深的層中發(fā)生，在此處，NMF的作用是防止皮膚脫水（Harding, 2000)。已經(jīng)證明，敷 到皮膚上的閉合貼片可以完全防止聚絲蛋白降解。
[0014] 聚絲蛋白轉(zhuǎn)化為NMF還受角質(zhì)細胞內(nèi)水活性的控制，并且僅在狹窄范圍內(nèi)發(fā) 生-如果水活性太高，聚絲蛋白是穩(wěn)定的，而如果其太低，水解酶將不能作用并且降解聚絲 蛋白（Harding, 2000)。由此，皮膚的水化狀態(tài)影響聚絲蛋白的降解過程。
[0015] 重要地，NMF的產(chǎn)生在角質(zhì)細胞內(nèi)產(chǎn)生很大的滲透壓。因此，直到角質(zhì)細胞已經(jīng)成 熟且加強，并且向角質(zhì)層的更表面層迀移時，才發(fā)生降解過程，在角質(zhì)層的更表層中周圍的 脂質(zhì)和其他細胞外成分平衡所產(chǎn)生的滲透壓（Harding，2000)。
[0016] 通常認為NMF包括通過對丙酮/醚處理的角質(zhì)層進行30分鐘水處理釋放的可水 提取的物質(zhì)（Jokura, 1995)。所述可水提取的物質(zhì)被認為是在角質(zhì)層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的全部的天然 保濕因子。典型地，匪？的組成大致為：氨基酸48.3%丨0410.2% ;尿酸2.1%;乳酸10.1%; 檸檬酸7. 9% ;其他有機酸2% ;尿素14%，和無機離子5. 2%。占NMF的5%的無機離子 包括鉀、鈉和鈣。鈣離子和鉀離子在表皮的終末分化中是重要的，并且在屏障受擾時消失， 而鎂離子加速角質(zhì)層中皮膚屏障的恢復（Nakagawa，2004)。羧酸R比略燒酮鈉（PCA)和乳酸 都是高度吸濕性的，并且充當有效的保濕劑，二者大約占NMF的10%。最大百分數(shù)的NMF是 占48 %的氨基酸，其中中性氨基酸占34. 5 %，酸性氨基酸占5 %，堿性氨基酸占其余的8 %。
[0017] 絲氨酸是在NMF內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最大的游離氨基酸，并且占NMF中發(fā)現(xiàn)的所有游離氨基 酸的36%。甘氨酸是第二大游離的氨基酸，占22%，接下來是丙氨酸，占NMF中游離氨基酸 的13%。組氨酸（8% )、鳥氨酸（7% )、瓜氨酸（6% )、精氨酸（6% )和脯氨酸（2% )也都 存在于NMF中。
[0018] 盡管自二十世紀六十年代以來一些皮膚研宄者就已經(jīng)了解NMF在皮膚水化中的 重要性，在二十世紀八十年代確定了 NMF與聚絲蛋白加工的關(guān)系，但是，僅隨著最近聚絲蛋 白功能喪失突變的鑒定才理解相關(guān)性的充分顯著性。
[0019] 已經(jīng)表明遺傳的聚絲蛋白基因（FLG)的功能喪失突變引起中度-至-重度尋常性 魚鱗病，并且使患者容易患特應(yīng)性皮炎，包括復發(fā)的或持續(xù)到成年期的早發(fā)型特應(yīng)性濕瘆 (early-onset atopic eczema)。在特應(yīng)性皮炎中，已經(jīng)表明PCA、尿刊酸和組氨酸的水平 與FLG基因型相關(guān)，其在攜帶多種FLG突變的患者中減少。已經(jīng)鑒定了 FLG基因中的多個 突變；這些變體中僅有兩種由約百分之九的源于歐洲的人攜帶，表明聚絲蛋白突變在特定 人口中的流行性。攜帶功能喪失的聚絲蛋白突變的患者在角質(zhì)層中在所有深度都具有顯著 減少的NMF水平。另外，與非攜帶者相比，聚絲蛋白突變的攜帶者表現(xiàn)出增加的經(jīng)表皮水分 流失。
[0020] 聚絲蛋白蛋白水解異?？赡茼憫?yīng)環(huán)境因素發(fā)生。如上文所示，低濕度減弱水解酶 使聚絲蛋白分解為NMF的能力，因此產(chǎn)生皮膚表面干燥。另外，已經(jīng)證明UV輻射減弱聚絲 蛋白向其NMF成分的天然降解。此外，皮膚中NMF水平隨年齡下降，并且這種下降已經(jīng)歸因 于在老年人中減少的聚絲蛋白原合成和減少的屏障功能。
[0021] 如上所示，角質(zhì)層中所包含的大約三分之一的水是結(jié)合水，其余的是游離水。增加 游離水的水平對角質(zhì)層的彈性沒有影響，并且是結(jié)合NMF的水為皮膚提供其彈性性質(zhì)。已 經(jīng)證明，通過外部施用含有NMF的保濕劑替代或補充皮膚中的NMF供應(yīng)是成功的治療干燥 病皮膚的方法（Weber, 2012)。
[0022] -些NMF成分已經(jīng)用于增濕賦形劑（moisturising vehicles)有幾十年了， 卻并不知曉它們?yōu)槭裁淳哂幸恍┳饔谩＠?，尿素早?943年就已經(jīng)包含在保濕膏中 (Harding, 2000)。然而，直到1966年才測量正常和特應(yīng)性患者的皮膚尿素水平，現(xiàn)在已知 該水平在患有特應(yīng)性皮炎的患者和老年人皮膚中是減少的。已經(jīng)表明局部施用尿素或其前 體精氨酸校正尿素的不足。乳酸鹽是在1946年首先報道用在保濕劑中作為魚鱗病的治療。 已經(jīng)表明，與不含乳酸鹽的保濕劑相比，其改善并且防止干性皮膚癥狀的重現(xiàn)。L-乳酸和 D，L-乳酸似乎是通過刺激角質(zhì)層中的神經(jīng)酰胺合成而起作用。PCA是最常見的單一 NMF成 分，并且已經(jīng)表明，由于肥皂清洗和/或年齡的原因而在皮膚的最外層中減少。已經(jīng)廣泛地 報道局部應(yīng)用PCA減輕干性皮膚的癥狀（Harding, 2000)。
[0023] 在皮膚內(nèi)，水可以通過被動擴散從角質(zhì)層迀移到大氣。水的這種正常的迀移稱為 經(jīng)表皮水分流失（TEWL)。這是由于對水滲透沒有絕對的屏障而導致的。在健康的表皮中， 在顆粒層/角質(zhì)層接界處的含水量應(yīng)該約為40%，在皮膚表面含水量應(yīng)該為15% -25%。 當含水量約為10%以下時，發(fā)生明顯的皮膚起皮。
[0024] 實踐皮膚病學（Practical Dermatology) (2012年7月，24 - 26)提到一種酪氨酸 衍生物，但沒有公開該衍生物的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該衍生物當局部施用時在相對短的時間內(nèi)顯著 增加（build)皮膚基質(zhì)的體積。沒有提供進一步的限制。
[0025] 現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)非天然的吸濕性氨基酸可用于水化，并且另外地增強皮膚和 角質(zhì)結(jié)構(gòu)（keratinaceous structures)的水分保持和攝取性質(zhì)。這些性質(zhì)還使得這些氨 基酸能夠充當可以與其他滲透增強劑協(xié)同作用的滲透增強劑。
[0026] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供用于增強動物外部角質(zhì)結(jié)構(gòu)的水化和/或水分保 持和/或攝取性質(zhì)的非天然的吸濕性氨基酸。優(yōu)選的所述結(jié)構(gòu)是皮膚，但是本發(fā)明的氨基 酸可以用在指甲、角、毛發(fā)和眼睛上。
[0027] 本發(fā)明還提供非天然的吸濕性氨基酸用于增強動物的外部角質(zhì)結(jié)構(gòu)的水化和/ 或水分保持和/或攝取性質(zhì)的用途。
[0028] 本發(fā)明還提供用于增強動物的外部角質(zhì)結(jié)構(gòu)的水化和/或水分保持和/或水分攝 取性質(zhì)的方法，所述方法包括向所述皮膚施用有效量的非天然的吸濕性氨基酸。
[0029] -個令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的單個氨基酸能夠增強基本上親脂性的藥物的滲 透或經(jīng)皮吸收，觀察到對于增加親脂性的增加的作用。本領(lǐng)域常規(guī)的滲透增強劑對不能充 分滲透皮膚的那些藥物表現(xiàn)出最大的作用。然而，本發(fā)明的氨基酸的增強作用表現(xiàn)為隨log P增加，以致該作用不如對那些具有更加親水的性質(zhì)的藥物那樣大，但是隨著增加的親脂性 而增加。
[0030] 用于本文時，術(shù)語"藥物"是指可以需要局部或經(jīng)皮施用的任意藥理學活性劑。
[0031] 因此，進一步提供非天然氨基酸作為旨在用于局部施用的藥物的滲透增強劑的用 途。示例性的此類藥物包括留體和保留在角質(zhì)層中并且與其粘合或結(jié)合到角蛋白的其他分 子，以及l(fā)og P>3的那些，但是滲透增強作用適用于所有用于局部施用的藥物，優(yōu)選那些較 親水性具有更多的親脂性的藥物。
[0032] 三種優(yōu)選的藥物和氨基酸組合為：甲硝唑（metronidazole)和N-羥基絲氨酸； 雙氯芬酸二乙胺（diclofenac diethylamine，DDEA)和N-羥基甘氨酸；以及阿昔洛韋 (acyclovir)和L-高絲氨酸。然而，通常，本發(fā)明優(yōu)選的氨基酸也優(yōu)選作為滲透增強劑，對 于本發(fā)明的大部分氨基酸，特別是具有至少〇. 7的0/C比的那些氨基酸，觀察到有益的作 用。1以上的0/C比是有益的。
[0033] 用作滲透增強劑的優(yōu)選的氨基酸包括N-羥基絲氨酸、N-羥基甘氨酸、L-高絲氨酸 和a-羥基甘氨酸。其他適當?shù)乃幬锶缦拢?br>[0034]
[0035]
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[0038]
[0040]
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[0043] 盡管在下文中常提到皮膚，但是，應(yīng)該理解，該術(shù)語包括對任意其他角質(zhì)結(jié)構(gòu)（諸 如指甲）以及其他外部膜（諸如角膜）的指代，除非上下文另外清楚指明。
[0044] 用于本文時，非天然氨基酸是這樣的：其不是由待治療的皮膚的宿主合成的，或者 不與專門的宿主tRNA相關(guān)聯(lián)。此類氨基酸、特別是不是由宿主合成的那些的優(yōu)點在于，它 們較少經(jīng)受代謝，諸如通過天然存在的酶進行的代謝，以致它們比天然存在的氨基酸更久 地保留在皮膚中，由此可以延長任何濕潤或滲透增強作用。
[0045] 術(shù)語"增濕"、"水分保留"和"水分攝取"以及相關(guān)的術(shù)語在舉例說明本發(fā)明時在 本文中可互換使用，并且提及一個就包括對其他的指代，除非上下文另外清楚指明。個別來 說，所述術(shù)語具有具體的意思。術(shù)語"增濕"是一個綜合性術(shù)語，并且表示導致干燥皮膚的 濕度水平的平衡或趨向平衡的過程的物質(zhì)或條件。增強的"水分保持"表示減小的皮膚允 許水分逸散的傾向性，并且"水分保持"表示皮膚保留水分的傾向性。"水分攝取"是皮膚從 環(huán)境（如濕空氣）吸收水分的性質(zhì)。術(shù)語"水化（hydration)"包括皮膚中的水的水平以及 水攝取到皮膚中的過程，諸如水分攝取，同前所述。
[0046] 用于本文時，術(shù)語"吸濕性"表示能夠在32°C從相對濕度（RH) < 50%、并且優(yōu)選 40%以下的大氣吸收并保持水分的氨基酸。
[0047] 對于吸濕性的化合物，其必須能夠與水形成非鍵合的締合（non-binding association)。硫酸鎂是非常吸濕性的，并且在水的氧原子和鎂原子之前形成非鍵合相互 作用。對什么使得化合物具有吸濕性的進一步的研宄導致在土壤樣品和氣溶膠上進行的工 作。在氣溶膠內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最豐富的游離氨基酸是甘氨酸、絲氨酸和丙氨酸。這些也是在NMF 內(nèi)發(fā)現(xiàn)的三種最豐富的游離氨基酸。在大氣氣溶膠實驗中腐殖物質(zhì)的吸濕性導致對所觀察 到的吸濕性與腐殖質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)之間的研宄（Sasaki，2007)。通過該工作，確定了具有較高 的氧/碳比（0/C)的化合物通常表現(xiàn)出更大的吸濕性性質(zhì)（Sasaki, 2007)。例如，L-絲氨 酸具有3個氧原子和3個碳原子，以致其具有O/C = 1. 0。
[0048] 本發(fā)明的氨基酸在32°C能夠潮解。優(yōu)選地，本發(fā)明的氨基酸在32°C具有不大于 80%的潮解相對濕度〇)RH)。本發(fā)明優(yōu)選的氨基酸具有在32°C的不大于80%的DRH和至少 0. 7 的 0/C 比。
[0049] 天然存在的氨基酸是動物中的L-氨基酸，并且要用本發(fā)明治療的優(yōu)選的動物是 哺乳動物。優(yōu)選的哺乳動物是具有暴露的或無毛的皮膚（不管是完全的還是部分的）的那 些，特別優(yōu)選是人。
[0050] 非天然氨基酸通常是D-氨基酸，但是在待治療的動物中不合成的L-氨基酸可以 包括少有的L-氨基酸，如a -羥基甘氨酸和L-高絲氨酸。
[0051] 在本發(fā)明的氨基酸是新的情形下，則提供這些氨基酸作為本發(fā)明的方面和實施方 案。
[0052] 本發(fā)明的氨基酸是包含通過一個或兩個并且優(yōu)選一個碳原子與酰亞胺或更優(yōu)選 地與胺基團連接的C00H基團的任意分子。盡管優(yōu)選本發(fā)明的氨基酸處于其游離的、兩性離 子形式，但是，它們還可以以溶液中的鹽形式或者作為離子對提供。
[0053] 本發(fā)明的氨基酸可以以任何適當?shù)男问绞┯玫狡つw，所述形式諸如霜劑、洗劑、凝 膠、油膏、軟膏、摩絲（mous