一種白頭翁提取物及其在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白頭翁提取物及其在制備防治肺纖維化 藥物中的應(yīng)用。 二、
【背景技術(shù)】：
[0002] 肺纖維化是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性疾病。目前治療肺纖維化的藥 物主要包括糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑和細胞毒類藥物。少部分接受糖皮質(zhì)激素治療的患 者顯示出一定的療效，但沒有完全或持續(xù)緩解者，副作用嚴(yán)重、長期療效不能確定等問題制 約了這些藥物的長期應(yīng)用。提高藥物的療效一直是廣大醫(yī)藥工作者追求的目標(biāo)。隨著對肺 纖維化發(fā)病學(xué)研宄的日益深入，已經(jīng)證實細胞外基質(zhì)（ECM)中膠原蛋白、彈性纖維以及蛋 白糖類的過量堆積是其特征性的病理組織學(xué)變化。目前，認為成纖維細胞的增殖和活化是 ECM大量形成和堆積的主要原因，肺泡上皮細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細胞的增生是成纖維細 胞的主要來源。在有害刺激、細胞因子等的作用下，成纖維細胞活化，分泌大量的ECM。盡管 對肺纖維化的發(fā)病機制有了更深入的認識，但臨床治療仍然不佳。
[0003] 中藥能夠在一定程度上改善肺纖維化終末期患者的生活質(zhì)量，但也存在藥理作用 機制和作用靶點不明確問題。因此，開發(fā)作用靶點明確、毒副作用小、長期服用安全可靠的 抑制肺纖維化中藥，具有重要的意義。
[0004] 白頭翁是毛茛科白頭翁Pulsatilla chinensis(Bge. )Regel的干燥根，是常用的 一種中藥材。白頭翁苦、寒。入歸胃、大腸經(jīng)。具有清熱解毒、涼血止痢的功效。臨床用于 熱毒血痢，里急后重，濕熱帶下，溫瘧寒熱；以及大便膿血、腸癌、腹瀉及多種感染等。白頭翁 提取物具有抗菌、抗阿米巴原蟲和滴蟲、抗腫瘤、抗組織胺、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等藥理作用。目前，發(fā) 現(xiàn)白頭翁含藥血清在體外可有效抑制人肺巨細胞癌細胞株P(guān)G細胞的生長，具有一定的細 胞毒性作用；白頭翁水提取物或醇提取物對包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤體內(nèi)、體外具有抑制 作用，除細胞毒作用外，還與誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成、抑制腫瘤細胞增殖等有關(guān)。另有研宄 發(fā)現(xiàn)，白頭翁皂苷的酶解產(chǎn)物可明顯促進皮膚纖維芽細胞的膠原蛋白合成。某些用于呼吸 系統(tǒng)疾病的中藥組合物中含有白頭翁，這些組合物可用于多種呼吸系統(tǒng)疾病，涉及支氣管 哮喘、急性支氣管炎、肺膿腫、病毒性肺炎、老年肺炎、肺癌和間質(zhì)性肺炎。也有一些來自于 白頭翁的單一化學(xué)成分可用于肺癌等治療的報導(dǎo)。尚未發(fā)現(xiàn)白頭翁提取物具有防治肺纖維 化的研宄報道。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種白頭翁提取物及其在制備防治肺纖維化藥 物中的應(yīng)用。白頭翁提取物通過抑制肺成纖維細胞的增殖、抑制肺泡上皮細胞向間質(zhì)細胞 的轉(zhuǎn)化，從而防治肺纖維化的形成和發(fā)展，使其在制備防治肺纖維化藥物中得到新的用途。
[0006] 本發(fā)明提供一種白頭翁提取物，所述白頭翁提取物是通過以下方法提取得到：
[0007] a、以白頭翁為原材料，加入白頭翁重量6~10倍的體積百分含量50~95%的乙 醇，然后置于閃式提取器中進行提??；將每次所得提取液過濾，合并濾液；所得剩余濾渣待 用；將所得濾液減壓濃縮至比重為1. 05~I. 10的浸膏；濃縮后的濾液采用石油醚進行萃 取，萃取后棄去石油醚液，下層水液揮去石油醚，將所得溶液在50~60°C下濃縮至相對密 度為1. 10~130的稠膏，減壓干燥得到白頭翁總皂苷粗品；
[0008] b、將步驟a待用的剩余濾渣中的乙醇蒸除，然后加入蒸餾水，所得濾渣與蒸餾水 的重量比為1 :8~16,加入蒸餾水后浸泡20~30min，浸泡后加熱煎煮提取2~3次，每次 100~120分鐘；每次煎煮提取后進行過濾，所得濾液合并；將所得濾液減壓濃縮至比重為 1. 10~1. 20的浸膏，離心20~30分鐘，離心后所得上清液中加入乙醇使乙醇含量達到體 積濃度為60~90%，乙醇邊加入邊攪拌，4~6°C條件下靜置12h，然后離心傾去上清液，收 集沉淀；采用無水乙醇洗滌所得沉淀，然后離心除去上清液，所得下層沉淀中再加入丙酮進 行洗滌、離心；離心后所得沉淀中再加入乙醚洗滌、離心，所得沉淀揮干乙醚，得到白頭翁多 糖；
[0009] C、將步驟a得到的白頭翁總皂苷粗品和白頭翁多糖混合均勻，得到白頭翁提取 物。
[0010] 根據(jù)上述的白頭翁提取物，a中所述提?。浩涮崛?~3次，每次提取時間為1~ 5min ;所述萃取，其萃取次數(shù)為2~3次。
[0011] 根據(jù)上述的白頭翁提取物，C中所述白頭翁總皂苷粗品和白頭翁多糖混合均勻，所 述混合時總皂苷粗品和多糖的混合質(zhì)量比為1~3:1。
[0012] 另外，提供一種上述白頭翁提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0013] 根據(jù)上述的白頭翁提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，白頭翁提取物在制 備防治肺纖維化藥物中應(yīng)用時，采用白頭翁提取物或以白頭翁提取物為主要成分的藥物組 合物。
[0014] 根據(jù)上述的白頭翁提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，所述白頭翁提取物 或者以白頭翁提取物為主要成分的藥物組合物，按照藥學(xué)常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑、顆粒 劑、丸劑、滴丸劑、散劑、口服液、糖漿劑或酒劑。
[0015] 為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，以下結(jié)合白頭翁提取物的藥理試驗實例及 其結(jié)果，說明白頭翁提取物在制備防治肺纖維化疾病藥物中的用途。
[0016] 實驗例1 :白頭翁提取物對人胚肺成纖維細胞（MRC-5)增殖的影響
[0017] 1)材料與方法:MRC-5細胞購于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。MEM培養(yǎng) 基（武漢博士德生物工程有限公司）、胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）。白頭 翁提取物：總皂苷和多糖按照質(zhì)量比例1. 5:1混合均勻，備用。
[0018] 3. 0 X IO3的MRC-5細胞加入到96孔板的板孔中，培養(yǎng)24h。吸出原培養(yǎng)液，加入含 有不同濃度（12. 5 μ g/mL、25 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL 和 200 μ g/mL)的白頭翁提取物 的完全培養(yǎng)液，以加入不含提取物的完全培養(yǎng)液作為正常對照。繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h 和72h，胰酶消化，顯微鏡下計數(shù)板計數(shù)細胞。
[0019] 2)實驗結(jié)果：詳見表1。在48h和72h，與正常組（0組）比較，100yg/mL、200 yg/ mL的白頭翁提取物組細胞數(shù)量顯著減少（P〈0. 05-0. 01)。
[0020] 表1白頭翁提取物對兩種細胞增殖的抑制作用（lOVmL，
[0021]
[0022] a'b，與正常組（0 組）比較，aP〈0. 05, bP〈0. 01。
[0023] 3)實驗結(jié)論：白頭翁提取物對MRC-5肺成纖維細胞的增殖有抑制作用。
[0024] 實驗例2 :白頭翁提取物對肺泡上皮細胞（A549)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
[0025] 1)材料與方法：A549細胞來自于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。 RPM1-1640培養(yǎng)基（Beijing Solarbio Science&Technology Co. Ltd)、胎牛血清（浙江天杭 生物科技股份有限公司）、Human TGF-β? (Pepro Tech Inc)出-媽粘蛋白抗體（E-cadherin Antibody;貨號 BA0475)、α-平滑肌肌動蛋白抗體（a smooth muscle actin(a-SMA) Antibody ;貨號BM0002)、即用型SABC-POD (小鼠 IgG)試劑盒（貨號SA1021)、即用型 SABC-POD(兔IgG)試劑盒（貨號SA1022)均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。白頭翁 提取物，總皂苷和多糖按照質(zhì)量比例1. 5:1混合均勻，備用。
[0026] 在24孔培養(yǎng)板的每個孔中加入玻璃片，然后在每個玻璃片上加入IX IO4細胞。將 培養(yǎng)板放入5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，使細胞貼壁于玻璃片。2h取出培養(yǎng)板，更換不含血清的 RPM1-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8h。吸除培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液；分為5組，即正常組（加入 RPM1-1640完全培養(yǎng)液）、TGF- β 1刺激組簡稱TGF- β 1組（加入含有5ng/mL TGF- β 1的 RPM1-1640完全培養(yǎng)液）、藥物干預(yù)組（加入含有5ng/mL TGF-β 1的RPM1-1640完全培養(yǎng) 液，培養(yǎng)液分別含有12. 5 μ g/mL、25 μ g/mL、50 μ g/mL的白頭翁提取物），繼續(xù)培養(yǎng)48h。
[0027] E-cadherin和a -SM檢測：取出細胞培養(yǎng)液后，每孔加入lmL、4%的多聚甲醛液， 37°C固定20min。PBS溶液洗滌，分別進行E-cadherin和a -SMA免疫細胞化學(xué)染色。分析 上述蛋白表達，結(jié)果以陽性表達的累積光密度數(shù)值（IOD)/細胞的面積（Area)表示。
[0028] 2)實驗結(jié)果：詳見表2。肺泡上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征性表現(xiàn)，是細胞特異性蛋白表 達的變化，即上皮細胞特異性蛋白E-cadherin表達量的減少，以及間質(zhì)細胞特異性蛋白如 a -SMA表達量的增加。與正常組比較，TGF-β 1組E-cadherin顯著降低（P〈0. 01)，a -SMA 顯著升高（Ρ〈0. 01)。與TGF-β 1組相比，12. 5、25和50 μ g/mL白頭翁提取物組E-cadherin 顯著升高（Ρ〈0· 001)，a -SMA 顯著降低（Ρ〈(λ 01-0. 001)。
[0029] 表2白頭翁提取物對TGF- β 1誘導(dǎo)Α549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響?±s )
[0030]
[0031] ο'。，TGF-β 丨組比較，aP〈0. 05, bP〈0. 01，cK0.00 1。
[0032] 3)實驗結(jié)論：TGF- β I誘導(dǎo)A549肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細胞，白頭翁提取物對 該轉(zhuǎn)化過程有抑制作用。
[0033] 綜上所述，本發(fā)明所涉及的白頭翁提取物具有防治肺纖維化的作用，具有制備防 治肺纖維化藥物的潛力及實際推廣價值。 四、【具體實施方式】：
[0034] 實施例1 :
[0035] 本發(fā)明白頭翁