-2單層細(xì)胞用于測(cè)定。將各孔設(shè)置在簇板上，并且用外側(cè) 培養(yǎng)基（基側(cè)，1.5 mL)和內(nèi)側(cè)培養(yǎng)基（腔側(cè)，0.5 mL)填充。每48小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基更換 培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)Caco-2單層細(xì)胞。
[0106] 刺激劑和測(cè)試脂肪酸溶液的添加 向通過(guò)上述方法制備的Caco-2單層細(xì)胞的各孔的內(nèi)側(cè)培養(yǎng)基中添加 HYA、HYB、KetoA、 KetoB或KetoC的溶液（各50 μ M濃度，500 μ L)，并且將混合物培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將 IFN- γ添加至外側(cè)培養(yǎng)基至50 ng/mL的最終濃度，并且培養(yǎng)24小時(shí)后，一次去除外側(cè)培養(yǎng) 基。將TNF-α添加至50 ng/mL，將混合物進(jìn)一步培養(yǎng)6小時(shí)，并且評(píng)估下述腸道屏障保護(hù) 作用。此外，準(zhǔn)備不含測(cè)試脂肪酸且添加 IFN-γ和TNF-α的孔，和不含測(cè)試脂肪酸溶液、 IFN-γ和TNF-α的孔（以下也稱(chēng)為對(duì)照）。
[0107] [實(shí)施例1] 腸道屏障保護(hù)作用的比較 使用跨上皮電阻（TER)值（Ω _cm2)和IL-8產(chǎn)生（pg/mL)作為指標(biāo)比較測(cè)試脂肪 酸溶液的腸道屏障保護(hù)作用。以使用Ag/AgCl電極的電阻值測(cè)量系統(tǒng)（Millicell-ERS， Mi 11 ipore)，測(cè)量添加 TNF- α后〇、1、2、3、4、5和6小時(shí)的各TER值。此外，通過(guò)將各孔的 TER值除以對(duì)照的TER值計(jì)算TER相對(duì)值（相對(duì)TER)。至于各IL-8產(chǎn)生量，培養(yǎng)后收集的 外側(cè)培養(yǎng)基進(jìn)行ELISA方法，并且TNF- α添加后6小時(shí)測(cè)量該值。
[0108] TER相對(duì)值的測(cè)量結(jié)果顯示于圖2Α和Β。該圖顯示平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE)(下 面測(cè)量結(jié)果中相同）。將IFN-γ和TNF-α添加至Caco-2單層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)降低了 TER相 對(duì)值。當(dāng)添加測(cè)試脂肪酸溶液時(shí)，只有HYA顯示TER相對(duì)值降低的抑制。IL-8的測(cè)量結(jié)果 顯示于圖3A。將IFN-γ和TNF-α添加至Caco-2單層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)增加了培養(yǎng)基中IL-8 的濃度。當(dāng)添加 HYA和HYB時(shí)，觀察到IL-8產(chǎn)生的抑制。
[0109] [實(shí)施例2] HYA對(duì)緊密連接相關(guān)閔子的基閔表汰的作用 以上述實(shí)施例中相同的方式，添加 HYA，并且6小時(shí)后，將Caco-2單層細(xì)胞用PBS洗滌 3次，并且用TRIzoI (注冊(cè)商標(biāo)）（由Life Technologies制造）從細(xì)胞提取RNA。使用高容 量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Life Technologies)逆轉(zhuǎn)錄RNA以得到cDNA，并且使用KAPA SYBR FAST ABI PRISM qPCR試劑盒（Kapa Biosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。作為引物，使用核苷 酸序列的寡DNA對(duì)：SEQ ID N0:3和4用于IL-8，SEQ ID N0:5和6用于密蛋白-1，SEQ ID N0:7和8用于Z0-1，SEQIDN0:9和10用于閉合蛋白，且SEQIDN0:11和12用于MLCK。
[0110] 基因表達(dá)分析的結(jié)果顯示于圖4。將IFN-γ和TNF-α添加至Caco-2單層細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)增加了肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK)的mRNA表達(dá)，并且降低閉合蛋白的mRNA表達(dá)。用 HYA添加細(xì)胞顯示抑制MLCK的mRNA表達(dá)的增加和閉合蛋白的mRNA表達(dá)的降低。如圖3B 中顯示，添加 IFN- γ和TNF- α增加 IL-8的mRNA表達(dá)；然而，添加 HYA和HYB抑制此類(lèi)表 達(dá)增加。
[0111] [實(shí)施例3] HYA對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的腸炎樽塑小鼠的作用 BALB/c 小鼠（早，6 周齡）購(gòu)自 Charles River Japan (Kanagawa, Japan)，并且所有 實(shí)驗(yàn)計(jì)劃根據(jù)廣島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)則（第CIO-17號(hào)）實(shí)施。通過(guò)允許自由攝取3.5% (w/ v) DSS (分子量36000-50000; MP Biomedicals, Aurora, OH, USA) 5 天誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎。 為了評(píng)估HYA和HYB對(duì)大腸的作用，將100 μ L HYA或HYB的懸浮液（各100 nmol)經(jīng)口 施用于小鼠。每天進(jìn)行該施用，持續(xù)總共10天，DSS施用前持續(xù)5天，施用開(kāi)始后持續(xù)5天。 基于體重減少、排泄物的狀況和肛門(mén)出血每天評(píng)估結(jié)腸炎的癥狀。施用DSS 5天后，將小鼠 處死，并且測(cè)量大腸的長(zhǎng)度。其后，通過(guò)使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen, Maryland, MD, USA)從大腸組織提取RNA。制作大腸組織的石蠟切片（7 μ m)，用蘇木精-伊紅染色，且組 織化學(xué)評(píng)估。使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Life Technologies)逆轉(zhuǎn)錄提取的RNA以得 到 cDNA，并且使用 KAPA SYBR FAST ABI PRISM qPCR 試劑盒（Kapa Biosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR分析。作為引物，使用核苷酸序列的寡DNA對(duì)：SEQ ID N0:5和6用于密蛋白-1，SEQ ID NO: 13和14用于密蛋白-3, SEQ ID NO: 15和16用于密蛋白-4, SEQ ID N0:7和8用于 Z0-1，SEQ ID N0:17 和 18 用于 Z0-2，SEQ ID N0:9 和 10 用于閉合蛋白，且 SEQ ID NOs: 11 和12用于MLCK。
[0112] 至于每個(gè)處理組中的小鼠，體重的時(shí)間-進(jìn)程變化顯示于圖5,體重降低顯示于圖 6,糞便評(píng)分顯示于圖7,且大腸的長(zhǎng)度顯示于圖8。施用HYA對(duì)于體重降低的抑制、糞便評(píng) 分的恢復(fù)和大腸的保護(hù)是有效的。
[0113] 大腸部分的組織化學(xué)評(píng)估（H&E染色）的結(jié)果顯示于圖9。盡管DSS處理顯著地 誘導(dǎo)大腸的上皮細(xì)胞的損傷和隱窩的減少，用HYA施用的小鼠顯示組織損傷的恢復(fù)。
[0114] 密蛋白-1、-3和-4、閉合蛋白、MLCK、Z0-1和Z0-2的mRNA表達(dá)顯示于圖10。DSS 小鼠顯著誘導(dǎo)密蛋白-1、3和4、閉合蛋白、Z0-1和Z0-2的異常mRNA表達(dá)（MLCK趨于增加）。 然而，與DSS小鼠相比，用HYA經(jīng)口施用的小鼠顯示閉合蛋白和MLCK的mRNA表達(dá)的顯著恢 復(fù)。另一方面，HYB沒(méi)有顯示所有TJ相關(guān)因子的異常表達(dá)的恢復(fù)。
[0115] 產(chǎn)業(yè)實(shí)用性 本發(fā)明已經(jīng)闡明，羥基化脂肪酸，特別是不飽和的羥基化脂肪酸，具有通常未知的腸道 屏障作用作為生理功能。含有此類(lèi)羥基化脂肪酸等的腸道保護(hù)劑適用于藥品、食品、飼料等 的各種領(lǐng)域，并且本發(fā)明在工業(yè)上極為有用。
[0116] 雖然本發(fā)明已經(jīng)著重于優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行描述，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易 見(jiàn)的是，可以改變優(yōu)選的實(shí)施方案。
[0117] 本文引用的任何出版物中公開(kāi)的內(nèi)容，包括專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，在其在本文中已經(jīng) 公開(kāi)的程度上，在此以其整體通過(guò)引用并入。
[0118] 本申請(qǐng)基于2013年2月21日在日本提交的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?013-031769,其內(nèi)容完整 地通過(guò)引用并入本文。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 腸道保護(hù)劑，其包含具有18個(gè)碳原子且在10位和/或12位具有羥基的羥基化脂肪 酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的腸道保護(hù)劑，其中所述羥基化脂肪酸是羥基化不飽和脂肪酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的腸道保護(hù)劑，其中所述羥基化不飽和脂肪酸在12位具有順式雙 鍵。4. 根據(jù)權(quán)利要求2的腸道保護(hù)劑，其中所述羥基化不飽和脂肪酸是10-羥 基-順-12-十八碳稀酸。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的腸道保護(hù)劑，其用于預(yù)防或改善由腸道屏障功能損傷 引起的疾病。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的腸道保護(hù)劑，其中所述由腸道屏障功能損傷引起的疾病是至少一 種選自炎性腸病、潰瘍和腸易激綜合征的疾病。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的腸道保護(hù)劑，其是食品或食品添加劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的腸道保護(hù)劑，其是藥品。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的腸道保護(hù)劑，其是飼料或飼料添加劑。10. 用于預(yù)防或治療溫血?jiǎng)游镏械哪c道屏障功能損傷或者由所述損傷引起的疾病的方 法，其包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的具有18個(gè)碳原子且在10位和/或12位具有羥基的羥 基化脂肪酸。11. 具有18個(gè)碳原子且在10位和/或12位具有羥基的羥基化脂肪酸，其用作腸道保 護(hù)劑。12. 具有18個(gè)碳原子且在10位和/或12位具有羥基的羥基化脂肪酸用于生產(chǎn)腸道保 護(hù)劑的用途。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了用于預(yù)防或改善由腸道屏障功能的損傷引起的疾病的腸道保護(hù)劑和藥劑，其含有羥基化脂肪酸，具體為在10位和/或12位具有一個(gè)或多個(gè)羥基的羥基化不飽和脂肪酸，所述羥基化脂肪酸是由乳酸細(xì)菌代謝不飽和脂肪酸的中間體。
【IPC分類(lèi)】A23K1/16, A61P1/04, A61P1/00, A23K1/165, C07C59/42, A23L1/30, A61K31/201, A61K31/20
【公開(kāi)號(hào)】CN104994846
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480009983
【發(fā)明人】小川順, 岸野重信, 米島靖記
【申請(qǐng)人】國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué), 日東藥品工業(yè)株式會(huì)社
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2014年2月13日
【公告號(hào)】WO2014129384A1