防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨質(zhì)疏松(osteoporosis，0P)是以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退化(松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)、斷裂數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄)為特征的，以致骨的脆性增高以及骨折危險增加的一種全身骨骼疾病。發(fā)病原因一般認(rèn)為與鈣及維生素缺乏、內(nèi)分泌失調(diào)、營養(yǎng)失調(diào)以及運動和光照不足有關(guān)。該病女性多于男性，常見于絕經(jīng)后婦女和老年人。隨著我國老年人口的增加，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率處于上升趨勢，在我國乃至全球都是一個值得關(guān)注的健康問題。
[0003]維生素D是激素前體，對維持血液中的正常的鈣離子濃度和磷酸化水平至關(guān)重要。當(dāng)人類的皮膚被陽光中的紫外線照射后，會產(chǎn)生足夠多的維生素D。由于人生活方式的改變，很多成年人因為不能照射到足夠的陽光，而無法產(chǎn)生出足夠的VD。因此通過日常飲食來補充維生素D變得越來越重要了。
[0004]近年研究發(fā)現(xiàn)，防治骨質(zhì)疏松不僅需要鈣、維生素D，而且還需要維生素K，尤其是VK2。研究確認(rèn)，維生素K2可作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨，組織鈣化，同時還能抑制破骨細(xì)胞，引起骨吸收，從而增加骨密度，不僅可防還可治骨質(zhì)疏松。骨鈣素是由成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞和肥大的軟骨細(xì)胞合成并分泌的蛋白質(zhì)，它主要存在于這三種細(xì)胞外的骨基質(zhì)中，小部分被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，所以血清骨鈣素為骨形成的重要指標(biāo)。依賴于維生素K的骨組織羧化系統(tǒng)使骨鈣素羧化變成具有生物學(xué)活性的羧化骨鈣素，與鈣結(jié)合，由無規(guī)則線團(tuán)變成螺旋結(jié)構(gòu)，羥基磷灰石結(jié)合，從而促進(jìn)骨形成。研究表明，維生素K1、K2、K3中，Kl有促進(jìn)鈣化作用，Κ2作用更強，而Κ3則沒有這一作用。
[0005]目前市場上預(yù)防骨質(zhì)疏松應(yīng)用較為廣泛的保健品是以碳酸鈣為主的超微化處理的含有鈣和維生素D的第3代復(fù)合制劑，如液體鈣+D3軟膠囊(液體鈣+維生素D);另外還有一些鈣與中藥復(fù)配的保健品如苗嶺牌骨立膠囊、靈芝乳酸鈣片等。這些產(chǎn)品都以鈣為主要成分，希望通過補鈣達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的結(jié)果。但是，攝入的鈣并不能保證被有效的吸收，即便有的產(chǎn)品加入維生素D，在機體缺少維生素Κ2的情況下，也不能保證吸收的鈣能被有效的利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是開發(fā)一款以含天然維生素Κ2(ΜΚ_7)的有益菌為原料、同時含有維生素D和鈣的安全綠色的防治骨質(zhì)疏松的產(chǎn)品。
[0007]具體技術(shù)方案為:
[0008]防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑，由以下方法制備所得:
[0009](I)納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)BLCC1-0053菌粉的制備:凍存的納豆芽孢桿菌BLCC1-0053種經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接到種子液體培養(yǎng)基中，在35?45°C條件下，靜置培養(yǎng)12?24h，制得種子液；以I?5%的接種量，將種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，35?45°C，100?180rpm培養(yǎng)12?24h，然后轉(zhuǎn)至40?50°C條件下，靜置培養(yǎng)5?7d ;發(fā)酵結(jié)束后，立即將發(fā)酵液離心并用清水清洗，離心條件為5000?10000rpm，5?15min，清洗2?3遍后冷凍干燥，粉碎，即為納豆芽孢桿菌菌粉。
[0010]納?芽抱桿菌(Bacillusnatto) BLCC1-0053，已于2014年I月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO M2014028 ;保藏地址為中國武漢的武漢大學(xué)，郵編為430072 ;所述的納豆芽孢桿菌BLCC1-0053產(chǎn)維生素K2，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測，MK-7的含量不低于3.68733mg/g0
[0011]其中，種子液體培養(yǎng)基各成分質(zhì)量含量為:葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%,酵母膏0.5%，其余為蒸餾水，pH值7.0。
[0012]液體發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量含量為:蛋白胨10%，丙三醇3%、NaCl0.5%,K2HPO40.02%，其余為蒸餾水，pH7.0-7.2。
[0013](2)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC4-0032 已于 2015 年 3 月 18 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M2015123，保藏地址為中國武漢的武漢大學(xué)，郵編為430072 ;釀酒酵母的發(fā)酵生產(chǎn):釀酒酵母在斜面培養(yǎng)基中經(jīng)斜面活化后轉(zhuǎn)接到種子液體培養(yǎng)基中，25?35°C條件下，120?200rpm振蕩培養(yǎng)18?30h，制得種子液；以I?5%的接種量，將種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25?35°C，120?200rpm振蕩培養(yǎng)18?30ho
[0014]其中，斜面培養(yǎng)基配各成分質(zhì)量含量為:葡萄糖2 %，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氫鉀0.2%，瓊脂粉1.5?2.0%，其余為蒸餾水。
[0015]種子液體培養(yǎng)基及液體發(fā)酵培養(yǎng)基為不含瓊脂的固體培養(yǎng)基，即葡萄糖2%，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氫鉀0.2%，其余為蒸餾水。
[0016](3)釀酒酵母紫外照射:離心收集菌體，用發(fā)酵液體積30%去離子水重懸菌體，紫外照射2?4h ;
[0017]紫外照射的波長為254?365nm。紫外照射后的酵母菌粉中維生素D (VD)的含量不低于 732.97ug/g，即 2931880IU/100go
[0018](4)離心收集菌體，離心條件為5000?10000rpm，5?15min，冷凍干燥后粉碎，即為釀酒酵母菌菌粉；釀酒酵母菌菌粉中維生素D的含量不低于732.97ug/g ;
[0019](5)產(chǎn)品復(fù)配:將納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣配成益生菌制劑產(chǎn)品，納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣混合的比例按照有效成分質(zhì)量比例配制，MK-7:VD:Ca2+= 30 ?300:1 ?10:160。
[0020]本發(fā)明提供的防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑，以含天然維生素K2(MK-7)的有益菌為原料、同時含有維生素D和鈣的安全綠色的防治骨質(zhì)疏松的產(chǎn)品，能有效提高鈣質(zhì)的吸收，可以防治骨質(zhì)疏松。
【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明實施例試驗過程中大鼠體重變化；
[0022]圖2是本發(fā)明實施例飼喂產(chǎn)品后各組大鼠骨礦含量；
[0023]圖3是本發(fā)明實施例飼喂產(chǎn)品前后骨礦含量增長情況；
[0024]圖4是本發(fā)明實施例飼喂產(chǎn)品后各組大鼠骨密度；
[0025]圖5是本發(fā)明實施例飼喂產(chǎn)品后各組大鼠骨密度增長情況；
[0026]圖6是本發(fā)明實施例中各組大鼠血清中P的含量；
[0027]圖7是本發(fā)明實施例中各組大鼠血清中Ca的含量。
【具體實施方式】
[0028]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0029]實施例1
[0030](I)納豆芽孢桿菌BLCC1-0053菌粉的制備
[0031]培養(yǎng)基配方:
[0032]種子液體培養(yǎng)基各成分質(zhì)量含量為:葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，其余為蒸餾水，pH值7.00
[0033]液體發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量含量為:蛋白胨10%，丙三醇3%、NaCl0.5%,K2HPO40.02%，其余為蒸餾水，pH7.0-7.2。
[0034]凍存的納豆芽孢桿菌BLCC1-0053種經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接到種子液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下，靜置培養(yǎng)16h，制得種子液；以5%的接種量，將種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，370C，120rpm培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)至42°C條件下，靜置培養(yǎng)5?7d ;發(fā)酵結(jié)束后，立即將發(fā)酵液離心并用清水清洗，離心條件為5000?lOOOOrpm，5?15min，清洗2?3遍后冷凍干燥，粉碎，即為納豆芽孢桿菌菌粉。
[0035]菌粉樣品經(jīng)過處理后，高效液相色譜(HPLC)結(jié)果顯示MK-7產(chǎn)量高達(dá)3.68733mg/
g°
[0036](2)釀酒酵母BLCC4-0032菌粉的制備
[0037]斜面培養(yǎng)基配各成分質(zhì)量含量為:葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，磷酸二氫鉀0.2%，瓊脂粉2.0%，其余為蒸餾水。
[0038]種子液體培養(yǎng)基及液體發(fā)酵培養(yǎng)基為不含瓊脂的固體培養(yǎng)基，葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，磷酸二氫鉀0.2%，其余為蒸餾水。
[0039]釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC