4-0032在斜面培養(yǎng)基中經(jīng)斜面活化后轉(zhuǎn)接到種子液體培養(yǎng)基中，30°C條件下，180rpm振蕩培養(yǎng)24h，制得種子液；以3%的接種量，將種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，300C，180rpm振蕩培養(yǎng)24h，離心收集菌體；
[0040]用發(fā)酵液體積30%去離子水重懸菌體，312nm紫外照射4h ；
[0041]離心收集菌體，冷凍干燥后粉碎，即為菌粉成品。
[0042]樣品處理后，經(jīng)HPLC檢測，樣品中VD含量高達(dá)732.97ug/g，即2931880IU/100g。
[0043](3)產(chǎn)品復(fù)配:將納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣配成益生菌制劑產(chǎn)品，納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣混合的比例按照有效成分質(zhì)量比例配制，MK-7:VD:Ca2+= 100:5:160。
[0044]實(shí)施例2
[0045]產(chǎn)品復(fù)配步驟中，納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣混合的比例按照有效成分質(zhì)量比例配制，MK-7:VD =Ca2+= 30:1:160。
[0046]其他步驟與實(shí)施例1相同。
[0047]實(shí)施例3
[0048]產(chǎn)品復(fù)配步驟中，納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣混合的比例按照有效成分質(zhì)量比例配制，MK-7:VD =Ca2+= 300:10:160。
[0049]其他步驟與實(shí)施例1相同。
[0050]產(chǎn)品功效驗(yàn)證
[0051 ] 試驗(yàn)動(dòng)物:Wistar大鼠，鼠齡6-8周，雌鼠
[0052]試驗(yàn)分組:將購買的大鼠分為7組，第I組，飼喂正常飼料，不做任何處理；第2組，維甲酸70mg/kg+生理鹽水，灌胃；第3組，維甲酸+低劑量產(chǎn)品，灌胃；第4組，維甲酸+高劑量產(chǎn)品，灌胃；第5組，生理鹽水，灌胃；第6組，生理鹽水+低劑量產(chǎn)品，灌胃；第7組，生理鹽水+高劑量產(chǎn)品，灌胃。
[0053]試驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)VK2的人體每日攝入推薦量(RDA)，選擇實(shí)施例1的產(chǎn)品，50ug/kg/d、500ug/kg/d兩個(gè)用藥劑量，分別為低低劑量、高劑量。大鼠購買進(jìn)實(shí)驗(yàn)室首先適應(yīng)飼喂I周，之后飼喂低鈣飼料3周后，DEXA(雙能X-線吸收儀)測量骨密度及骨礦物質(zhì)含量。注射激素造模，同時(shí)灌胃產(chǎn)品3周，DEXA測量骨密度及骨礦物質(zhì)含量，麻醉(戊巴比妥鈉)，開膛心臟取血或者腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行相關(guān)血液指標(biāo)測定。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055](I)大鼠體重變化
[0056]因維甲酸副作用導(dǎo)致大鼠死亡，因此2、3、4組灌胃維甲酸一周后停止維甲酸造模，只進(jìn)行低鈣飼喂造模。每天灌胃前稱量大鼠體重，一周為一個(gè)單位，計(jì)算大鼠平均體重，研究6周內(nèi)大鼠體重變化，結(jié)果如圖1所示。
[0057]由圖可以看出，前3周各組的大鼠體重保持增長，第4周開始，維甲酸造模組體重下降，在停止使用維甲酸后飼喂產(chǎn)品組體重開始增加，而且增長速度要比未飼喂產(chǎn)品組快。而其他低鈣飼喂組大鼠的體重與空白對(duì)照組一樣保持持續(xù)增長，說明灌胃產(chǎn)品不會(huì)對(duì)大鼠的正常生長產(chǎn)生影響。
[0058](2)骨礦含量(BMC)變化
[0059]飼喂產(chǎn)品前后分別使用DEXA(雙能X-線吸收儀)測量各組大鼠骨礦物質(zhì)含量。試驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠骨礦含量如圖2所示；飼喂產(chǎn)品前后大鼠骨礦含量增長情況如圖3所示。
[0060]由圖可以看出，低鈣飼喂組的BMC顯著低于空白對(duì)照組，說明低鈣飼導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松，而產(chǎn)品灌胃組第6組大鼠骨礦含量與空白組無差異，保持正常水平。在對(duì)6組、7組大鼠進(jìn)行產(chǎn)品灌胃后，其BMC的增長量要顯著高于未灌胃產(chǎn)品組即第5組，說明灌胃產(chǎn)品能顯著增加大鼠的骨礦含量。
[0061]骨密度(BMD)變化
[0062]飼喂產(chǎn)品前后分別使用DEXA(雙能X-線吸收儀)測量各組大鼠骨密度。試驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠密度如圖4所示；飼喂產(chǎn)品前后大鼠骨密度增長情況如圖5所示。
[0063]由圖可以看出，低鈣飼喂導(dǎo)致大鼠的BMD顯著降低，而在對(duì)6、7組大鼠進(jìn)行K2產(chǎn)品灌胃后，相對(duì)于骨密度持續(xù)降低的第5組，6組、7組的骨密度顯著增加。
[0064](3)血清中磷⑵和鈣(Ca)的含量
[0065]試驗(yàn)結(jié)束后，用戊巴比妥鈉麻醉各組存活大鼠，開膛心臟取血或者腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行相關(guān)血液指標(biāo)測定。血清中P和Ca含量分別如圖6、圖7所示。
[0066]由圖可以看出，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清P含量差異不顯著，而鈣的的水平有差異，第4組和7組的大鼠的血清鈣水平與正常組無差異，而顯著高于低鈣飼喂且無灌胃產(chǎn)品的對(duì)照組，說明產(chǎn)品能夠促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣的吸收，補(bǔ)充機(jī)體鈣的缺乏癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0067]通過骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵指標(biāo):骨礦含量(BMC)、骨密度(BMD)可以看出通過向大鼠灌胃含VK2菌粉和VD等成分的復(fù)合產(chǎn)品，可以顯著提高其骨礦含量(BMC)、骨密度(BMD)，改善大鼠的骨質(zhì)疏松狀況，對(duì)于促進(jìn)鈣吸收以及骨骼的正常代謝具有一定的作用。
[0068]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑，其特征在于:由以下方法制備所得: (1)納豆芽孢桿菌菌粉的制備:凍存的納豆芽孢桿菌種經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接到種子液體培養(yǎng)基中，在35?45°C條件下，靜置培養(yǎng)12?24h，制得種子液；以I?5%的接種量，將種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，35?45°C，100?180rpm培養(yǎng)12?24h，然后轉(zhuǎn)至40?50°C條件下，靜置培養(yǎng)5?7d ;發(fā)酵結(jié)束后，立即將發(fā)酵液離心并用清水清洗，離心條件為5000?.10000rpm，5?15min，清洗2?3遍后冷凍干燥，粉碎，即為納豆芽孢桿菌菌粉； (2)釀酒酵母的發(fā)酵生產(chǎn):釀酒酵母在斜面培養(yǎng)基中經(jīng)斜面活化后轉(zhuǎn)接到種子液體培養(yǎng)基中，25?35°C條件下，120?200rpm振蕩培養(yǎng)18?30h，制得種子液；以I?5%的接種量，將種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25?35°C，120?200rpm振蕩培養(yǎng)18?30h ； (3)釀酒酵母紫外照射:離心收集菌體，用發(fā)酵液體積30%去離子水重懸菌體，紫外照射2?4h ;紫外照射的波長為254?365nm ; (4)離心收集菌體，離心條件為5000?10000rpm，5?15min，冷凍干燥后粉碎，即為釀酒酵母菌菌粉；釀酒酵母菌菌粉中維生素D的含量不低于732.97ug/g ; (5)產(chǎn)品復(fù)配:將納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣配成益生菌制劑產(chǎn)品，納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣混合的比例按照有效成分質(zhì)量比例配制，MK-7:VD:Ca2+= 30 ?300:1 ?10:160。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑，其特征在于:步驟(I)所述的種子液體培養(yǎng)基各成分質(zhì)量含量為:葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，其余為蒸餾水，pH值7.0 ; 步驟(I)所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量含量為:蛋白胨10%，丙三醇3 %、NaCl0.5%, K2HPO40.02%，其余為蒸餾水，ρΗ7.0-7.2。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑，其特征在于:步驟(2)所述的斜面培養(yǎng)基配各成分質(zhì)量含量為:葡萄糖2 %，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氫鉀.0.2%，瓊脂粉1.5?2.0%，其余為蒸餾水； 步驟(2)所述的種子液體培養(yǎng)基及液體發(fā)酵培養(yǎng)基各成分質(zhì)量含量為:葡萄糖2%，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氫鉀0.2%，其余為蒸餾水。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑由納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)后得到納豆芽孢桿菌菌粉，釀酒酵母養(yǎng)基、紫外照射得到釀酒酵母菌菌粉；納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉以及碳酸鈣配成。本發(fā)明提供的防治骨質(zhì)疏松的益生菌制劑，以含天然維生素K2(MK-7)的有益菌為原料、同時(shí)含有維生素D和鈣的安全綠色的防治骨質(zhì)疏松的產(chǎn)品，能有效提高鈣質(zhì)的吸收，可以防治骨質(zhì)疏松。CCTCC NO：M 201512320150318
【IPC分類】A61K31/59, A61P19/10, A61K33/10, A61K36/064, A61K35/742
【公開號(hào)】CN105055458
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510330452
【發(fā)明人】單寶龍, 約克·杰克畢, 王靜, 任寶濤, 張顏廷, 劉虹, 張化朋, 王麗春, 張?jiān)旗o
【申請(qǐng)人】山東鳳凰生物有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年6月15日