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毛蕊花苷-金納米顆粒復(fù)合物在治療人或動物白血病中的應(yīng)用

文檔序號:9337031閱讀:686來源:國知局
毛蕊花苷-金納米顆粒復(fù)合物在治療人或動物白血病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域,毛蕊花苷-金納米顆粒復(fù)合物在治療人或動物白血病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是惡性腫瘤的統(tǒng)稱。白血病是一種預(yù)后較差,死亡率較高的惡性腫瘤疾病,其嚴重危害人類健康和生命,曾被稱為不治之癥。急性白血病是病情非常兇險的一種疾病,患急性白血病患者若不經(jīng)特殊治療,其生存時間最多只有三個月,若該患者受到感染,或者是顱內(nèi)出血,必死無疑。白血病治療的一個重要手段是化療,大部分病人往往會因白血病細胞的多藥耐藥而導(dǎo)致化療無效或逐漸由有效轉(zhuǎn)為無效。
[0003]金納米顆粒(gold nanoparticle, Au)因其獨特的結(jié)構(gòu)、催化性能等優(yōu)點在大多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,在過去的十年,Au已在臨床診斷和治療癌癥過程中得到了廣泛應(yīng)用,并且隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展,作為一種有效、安全的藥物載體,Au在癌癥治療領(lǐng)域獲得越來越多的關(guān)注。
[0004]《毛蕊花苷對MPP+誘導(dǎo)的SHSY5Y細胞凋亡的保護作用》中雖然公開了毛蕊花苷(Verbascoside, VB)能抑制MPP+誘導(dǎo)的SHSY5Y細胞凋亡,并且VB對神經(jīng)細胞的保護作用可能與其降低細胞內(nèi)活性氧水平,維持線粒體膜電位的高能狀態(tài)和抑制Caspase-3的活性有關(guān)。然而,上述發(fā)明所指向的病癥是帕金森病,并沒有提及VB對腫瘤細胞特別是人白血病細胞K562的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員并不清楚VB是否具有促進腫瘤細胞凋亡進而達到抑制腫瘤生長的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供毛蕊花苷-金納米顆粒復(fù)合物(VB-Au)在治療人或動物白血病中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]VB-Au在制備治療人或動物白血病的藥物中的應(yīng)用;優(yōu)選VB-Au在制備誘導(dǎo)人白血病細胞K562凋亡的藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所述的應(yīng)用,優(yōu)選將VB包被Au制備成VB-Au復(fù)合物使用。本發(fā)明所述的VB-Au復(fù)合物可通過現(xiàn)有技術(shù)制備。
[0009]有益效果:
[0010]實驗研究表明,同正常對照組(NC)相比,VB或VB-Au復(fù)合物均能促使人白血病K562細胞在體內(nèi)外發(fā)生凋亡,但同VB處理組相比,VB-Au在體內(nèi)外促使人白血病K562細胞發(fā)生凋亡的作用更加顯著,加之VB-Au復(fù)合物成本低、易合成、毒副作用小等,因此VB-Au復(fù)合物有望用于制備治療人或動物白血病藥物。
【附圖說明】
[0011]圖1顯示運用電鏡鑒定合成的VB-Au復(fù)合物。A和C:Au納米顆粒的掃描電鏡圖(A)和透射電鏡圖(C)出和D:VB-Au的掃描電鏡圖⑶和透射電鏡圖⑶。
[0012]圖2顯示電鏡觀察K562細胞經(jīng)VB-Au處理48h后,細胞核凝縮及核碎裂情況。A和C:未經(jīng)處理的K562細胞的透射電鏡圖㈧和掃描電鏡圖(C) ;B和D:經(jīng)VB-Au處理的K562細胞的透射電鏡圖⑶和掃描電鏡圖(D)。
[0013]圖3顯示經(jīng)VB-Au處理后K562細胞的凋亡狀況。A:未經(jīng)處理的K562細胞;B,C和D:經(jīng)VB-Au處理24h(B),48h(C)及72h(D)后,凋亡的K562細胞量不斷增加。
[0014]圖4顯示經(jīng)Au,VB及VB-Au分別處理K562細胞72h后,MTT檢測各組細胞的細胞活力。結(jié)果顯示,同未經(jīng)處理的細胞(NC)相比,VB及VB-Au都可明顯抑制細胞的活力,而VB-Au抑制細胞活力的作用比VB更顯著。
[0015]圖5顯示經(jīng)Au,VB及VB-Au分別處理K562細胞72h后,流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡。圖6為對圖5細胞凋亡的定量分析。同樣發(fā)現(xiàn),同未經(jīng)處理的細胞(NC)相比,VB及VB-Au都可顯著誘導(dǎo)細胞的凋亡,而VB-Au促使細胞凋亡的作用比VB更顯著。
[0016]圖7顯示進一步運用吖啶橙/溴化乙錠染色(Α0/ΕΒ染色)分析經(jīng)VB-Au處理的K562細胞的凋亡情況。A和B:K562細胞經(jīng)VB-Au復(fù)合物處理24h前(A)、后(B)的早期凋亡圖;C和D:K562細胞經(jīng)VB-Au復(fù)合物處理72h前(C)、后(D)的晚期凋亡圖。
[0017]圖8顯示K562細胞經(jīng)不同組處理后發(fā)生凋亡的DNA片段分析圖。A:為各組處理24h后的結(jié)果:為各組處理細胞48h后的結(jié)果;C:為各組處理72h后的結(jié)果;D:為各組處理Oh的圖片。其中,泳道I為正常對照組,泳道2為經(jīng)VB單獨處理組,泳道3為經(jīng)VB-Au復(fù)合物處理組。結(jié)果顯示,VB和VB-Au都可時間依賴性的誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡,然而,同VB處理組相比,VB-Au誘導(dǎo)細胞凋亡的作用更加顯著。
[0018]圖9顯示免疫印跡法(Western Blot)檢測經(jīng)Au,VB及VB-Au處理的K562細胞中相關(guān)凋亡蛋白的表達。A:檢測各處理組細胞中Cleaved cas 9、Cleaved cas 8和Cleavedcas 3蛋白的表達水平,其中泳道I為未經(jīng)過處理的正常的K562細胞;泳道2為經(jīng)Au處理的K562細胞;泳道3為經(jīng)VB處理的K562細胞;泳道4為經(jīng)VB-Au復(fù)合物處理的K562細胞;B,C 和 D:分別為對 Cleaved cas 9(B)、Cleaved cas 8 (C)和 Cleaved cas 3 (D)蛋白表達的定量分析。結(jié)果顯示,VB和VB-Au都可誘導(dǎo)以上3中凋亡相關(guān)蛋白的表達,但同VB處理組相比,VB-Au可更有效的誘導(dǎo)Cleaved cas 9、Cleaved cas 8和Cleaved cas 3蛋白的表達。
[0019]圖10顯示經(jīng)腹腔注射VB-Au及其他對照組后,各組小鼠K562腫瘤的改變。A和C:植瘤小鼠經(jīng)腹腔注射PBS、Au、VB和VB-Au后,檢測各組小鼠腫瘤的大小,其中圖(A)為腫瘤圖片觀察,圖(C)為腫瘤體積檢測;B:各組植瘤小鼠注射PBS、Au、VB和VB-Au期間,腫瘤體積隨時間的變化情況;D:各組小鼠腫瘤組織進行蘇木素-伊紅染色(H-E染色)分析。結(jié)果表明,同PBS組相比,經(jīng)VB和VB-Au治療后可顯著抑制小鼠K562腫瘤的生長、誘導(dǎo)組織中腫瘤細胞的凋亡。但VB-Au復(fù)合物的作用較VB更顯著。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]在5ml 20nm的金納米顆粒(Au)溶液中,加入0.4ml水和2.6ml IM的SH-PEG-C00H (分子量 5000),15min 后,加入 4ml 的 1M 的 SH-PEG (分子量 5000),20min 后,離心(10000g/min,30min),取底部沉淀液,去離子水稀釋到5ml,碳酸鉀溶液調(diào)PH為8,加熱到60度,隨后,加入2ml IM的毛蕊花糖苷(VB)溶液,進行酯化反應(yīng)。反應(yīng)2h后,離心去底部沉淀液,即為20nm的金納米顆粒共價鍵修飾毛蕊花糖苷的復(fù)合物(VB-Au)。最后可通過掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)分別測量Au和VB-Au復(fù)合物的大小,結(jié)果見圖1,由圖可看出,VB-Au納米顆粒復(fù)合物的大小約為20nm。
[0022]實施例2
[0023]K562細胞購自天津血液學(xué)研究所,用添加10% GIBCO胎牛血清和青霉素(100U/ml)的1640培養(yǎng)基,在37°C、pH值7.2?7.4,二氧化碳濃度為5%,且濕氣充足的培養(yǎng)箱中無菌恒溫培養(yǎng)。為了檢測VB-Au對K562細胞活力的影響,取100 μ L VB-Au加入到Κ562細胞中,繼續(xù)放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后,運用SEM和TEM觀察細胞的形態(tài)變化,結(jié)果見圖2,由圖A,B可看出,細胞加藥后發(fā)生核破裂,由圖C,D可看出,細胞加藥后發(fā)生核萎縮。
[0024]實施例3
[0025]將K562細胞接種到孔板中,其中一組作為正常對照組,其余分別添加100 μ LVB-Au納米顆粒復(fù)合物,于37 °C、pH值7.2?7.4,二氧化碳濃度為5%并且濕氣充足的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h,用顯微鏡觀察細胞的凋亡狀況,結(jié)果見圖3,由圖可知,VB-Au可促使細胞發(fā)生凋亡,并且隨著處理時間的延長,凋亡的細胞數(shù)量也逐漸增加。
[0026]實施例4
[0027]將K562細胞進行計數(shù),根據(jù)計數(shù)結(jié)果將K562細胞按2X 14Cells/孔的密度接種于96孔板中,每孔100 μ L。于37°C、pH值7.2?7.4,二氧化碳濃度為5%并且濕氣充足的培
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