養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，其中一組作為正常對照組，其余分別添加5 μ L Au、VB及VB-Au納米顆粒復合物，72h后，向各孔中加入1yL MTT(5mg/mL)，37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出孔板，棄培養(yǎng)液，向各孔中加入100 μ L DMS0，溶解紫色結(jié)晶，然后將96孔板放入酶標儀中37°C孵育lOmin，在570nm波長下讀取吸光度值。結(jié)果見圖4，由圖可知，同其他對照組相比，經(jīng)VB-Au納米顆粒處理后的K562細胞的活力顯著降低，即=VB-Au可有效抑制細胞的存活。
[0028]實施例5
[0029]將K562細胞接種到1cm培養(yǎng)皿中，其中一組作為正常對照組，其余添加200uLVB-Au納米顆粒后于37°C、pH值7.2?7.4，二氧化碳濃度為5%并且濕氣充足的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收集細胞進行流式檢測，步驟如下:
[0030](I)將K562細胞收集到15mL的離心管中，每樣本細胞數(shù)為lX106cells/mL，1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。
[0031](2)用PBS緩沖液洗滌I次，1000r/min離心5min，棄去上清液。
[0032](3)用100 μ L的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10?15min。
[0033](4) 1000r/min離心5min，沉淀細胞用PBS緩沖液洗I次。
[0034](5)加入熒光溶液4°C下孵育20min，避光并不時振動。
[0035](6)流式細胞儀分析:流式細胞儀激發(fā)光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC焚光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI。
[0036](7)結(jié)果判斷:凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/P1-);右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)(FITC+/P1-)。結(jié)果見圖5，由圖可知，經(jīng)VB-Au納米顆粒復合物處理后的K562細胞凋亡的細胞量最多。根據(jù)實
[0037]施例5的實驗，對實驗結(jié)果進行定量分析，結(jié)果見圖6，由圖可知，同VB處理組相比，經(jīng)VB-Au納米顆粒復合物處理后，K562細胞凋亡的數(shù)量顯著增加。
[0038]實施例7
[0039]將K562細胞接種到孔板中，添加20 μ L VB-Au納米顆粒復合物后于37°C、pH值
7.2?7.4，二氧化碳濃度為5%并且濕氣充足的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h或72h，用胰酶消化細胞，隨后向細胞懸液中加入I μ L Α0/ΕΒ染色液混合物(100 μ g/mL吖啶橙和100 μ g/mL溴化乙錠)，在熒光顯微鏡下觀察凋亡的細胞，結(jié)果見圖7。由圖可知，同未經(jīng)處理的正常細胞相比，經(jīng)VB-Au納米顆粒處理的K562細胞經(jīng)染色后橙紅色或紅色的細胞(注:發(fā)生凋亡的細胞顯示紅色)量增加，并且隨著處理時間的延長，凋亡細胞的數(shù)量顯著增加。
[0040]實施例8
[0041](I)收集分別經(jīng)VB、VB-Au納米顆粒復合物處理24h、48h和72h后的K562細胞17個到15mL離心管中，以100rpm離心5min后去上清液，其中未經(jīng)處理的正常細胞作為對照；
[0042](2)向所述15mL離心管中加入50 μ L細胞裂解液，吹打混勻10秒鐘，以4500rpm離心5min后，取上層液A于1.5mL離心管中；再次向所述15mL離心管中加入50 μ L所述細胞裂解液，吹打混勻10秒鐘，以4500rpm離心5min，取上層液A和B于所述1.5mL離心管中；
[0043](3)于所述1.5mL離心管中加入5 μ L A液混勻，放入30°C ± 1°C孵育1min ；
[0044](4)再于所述1.5mL離心管中加入5 μ L B液混勻，放入50°C ± 1°C水浴鍋中過夜孵育10?12h ；
[0045](5)再于所述1.5mL離心管中加入5 μ L醋酸銨溶液混勻，并加入100 μ L異丙醇充分混勻后放入_20°C冷凍lOmin，然后以13000rpm離心lOmin，去除上層液C，得到DNAladder 沉淀；
[0046](6)所述DNA ladder沉淀中加入500 μ L的質(zhì)量濃度為70%的乙醇，以13000rpm離心lOmin，去除上層液D，得到洗滌后的DNA ladder沉淀；
[0047](7)所述洗滌后的DNA ladder沉淀室溫下瞭干1min后加入30 μ L DNAladder溶解液，然后采用凝膠成像系統(tǒng)進行凝膠電泳實驗，Ih后采用凝膠成像系統(tǒng)進行紫外檢測即可。
[0048]所述步驟(7)中采用凝膠成像系統(tǒng)進行凝膠電泳實驗的條件是指瓊脂糖膠的質(zhì)量濃度為1.2%，電壓為80V，溫度為常溫，進樣方式為點樣，進樣量為10 μ L。
[0049]所述步驟(7)中采用凝膠成像系統(tǒng)進行紫外檢測的條件是指波長為254nm，溫度為常溫，進樣量為10 μ Lo
[0050]結(jié)果見圖8，由圖可知，未經(jīng)處理的正常Κ562細胞沒有凋亡條帶出現(xiàn)，且同VB處理組相比，經(jīng)VB-Au納米顆粒復合物處理的K562細胞經(jīng)提取DNA ladder后可見清晰條帶，并且隨著處理時間的延長，條帶越清晰。由此可見，同單獨VB處理組相比，VB-Au納米顆粒復合物促使K562細胞發(fā)生凋亡的效果最好。
[0051]實施例9
[0052]向處于對數(shù)期的K562細胞中加入等量的Au、VB、VB-Au，分別培養(yǎng)48h，其中，未處理的正常細胞作為對照。收集處理的細胞，用RIPA緩沖液進行裂解提取蛋白，隨后用BCA試劑盒測定蛋白濃度，然后將等量樣品上樣到配制好的10% SDS-PAGE膠上，進行電泳，隨后進行轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體及顯影。結(jié)果見圖9，由圖可知，同其他對照組相比，經(jīng)VB-Au納米顆粒復合物處理的K562細胞，促凋亡蛋白Cleaved cas 9、Cleaved cas 8和Cleaved cas3的表達量明顯增加，因而，VB-Au納米顆粒復合物可更好的促使K562細胞發(fā)生凋亡。
[0053]實施例10
[0054]取處于對數(shù)期的K562細胞，對8只裸鼠出周齡的雌鼠)進行皮下植瘤，每2天觀察一次腫瘤生長情況。約植瘤后一周，待腫瘤生長至200_3，將植瘤鼠隨機分四組，分別經(jīng)腹腔注射PBS、Au、VB和VB-Au，注射劑量為200 μ L/次，隔天給藥并持續(xù)給藥2_3周。給藥結(jié)束后，處死裸鼠并取出腫瘤。經(jīng)石蠟包埋，制成切片，經(jīng)H-E染色觀察不同組之間腫瘤組織中腫瘤細胞的凋亡情況。結(jié)果見圖10，由圖可知，同其他對照組相比，經(jīng)VB-Au納米顆粒復合物注射后，小鼠腫瘤的體積明顯減小，且腫瘤組織中腫瘤細胞的凋亡顯著增加，說明VB-Au納米顆粒復合物可更有效的抑制腫瘤生長，促使腫瘤細胞的凋亡。
【主權(quán)項】
1.毛蕊花苷-金納米顆粒復合物在治療人或動物白血病中的應用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于將毛蕊花苷包被金納米顆粒制備成毛蕊花苷-金納米顆粒復合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于毛蕊花苷-金納米顆粒復合物在制備誘導人白血病細胞K562凋亡的藥物中的應用。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于毛蕊花苷-金納米顆粒復合物在抑制人白血病惡性腫瘤生長，誘導腫瘤組織中腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了毛蕊花苷-金納米顆粒復合物在治療人或動物白血病中的應用。經(jīng)過多種實驗充分證明了，毛蕊花苷-金納米顆粒復合物可明顯降低腫瘤細胞的活力、增強腫瘤細胞的凋亡，特別地毛蕊花苷-金納米顆粒復合物可顯著抑制植瘤小鼠腫瘤的生長、誘導小鼠腫瘤組織中腫瘤細胞的凋亡，為癌癥的治療提供了一種新思路。
【IPC分類】A61K31/7032, A61P35/02, A61K47/48
【公開號】CN105056249
【申請?zhí)枴緾N201510435728
【發(fā)明人】袁毅, 張亞琴, 劉賓, 郭志睿, 吳友農(nóng), 張偉
【申請人】袁毅, 南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月22日