素的RPMI培養(yǎng)基更換 之前的培養(yǎng)基。在第一次轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染以改善轉(zhuǎn)染效率。使用"siGLO 綠色轉(zhuǎn)染指示器"評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。在第一轉(zhuǎn)染后至少50小時(shí)進(jìn)行所有測(cè)定。
[0254] 藥物暴露：為了確定在急性細(xì)胞因子刺激對(duì)激酶磷酸化的作用中Tpl2的影 響，在Krebs-Ringer Bicarbonate (KRB)緩沖液中進(jìn)行短期實(shí)驗(yàn)，所述Krebs-Ringer Bicarbonate(KRB)緩沖液：對(duì)于INS-IE細(xì)胞為無(wú)葡萄糖HEPES平衡的KRB(KRBH) (135mM NaCl，3. 6mM KCl，0.5mM NaH2P04,0.5mM MgCl2，1.5mM CaCl2,5mM NaHCO3,和 IOmM HEPES， pH 7. 4,含有 0. 1%BSA);對(duì)于小鼠胰島為 KRB 緩沖液（120mM NaCl，4. 7mM KCl，1.2mM KH2PO4,1. 2mM MgS04,2. 5mM CaCl2,和 24mM NaHCO3, pH 7. 4,含有 0· 1% BSA 和 I. ImM 葡萄 糖）。于37°C，用或不用Tpl2抑制劑（3 μ M)預(yù)孵育INS-IE細(xì)胞或小鼠胰島（每種條件 下200-300個(gè)胰島）2小時(shí)，然后用或不用Τρ12抑制劑（3 μ Μ)、葡萄糖（IOmM)、單獨(dú)的 11^-10(1〇〇〇〇1]/1111，2〇1^/1111)、細(xì)胞因子混合物（11^-10(1〇〇1]/1111，〇.21^/1111)、丁陬〇(5〇〇1]/ ml，50ng/ml)、和 IFNy (100U/ml，30ng/ml)、或毒蜥外泌肽-4(20ηΜ)孵育 INS-IE 細(xì)胞或小 鼠胰島不同的時(shí)間（〇、5、10、20、或30分鐘）。
[0255] 為了評(píng)估在慢性暴露于細(xì)胞因子的條件下Τρ12的作用，在含有2mM谷氨酰胺、 100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、和葡萄糖（對(duì)于INS-IE細(xì)胞和小鼠胰島為11. ImM，和 對(duì)于人胰島為5. 6mM)的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。用熱滅活的FCS (對(duì)于INS-IE 細(xì)胞為7. 5%和對(duì)于小鼠胰島為10% )或白蛋白（對(duì)于INS-IE細(xì)胞為用于單獨(dú)的IL-I β 的0.5% BSA，對(duì)于人胰島為2%人白蛋白）補(bǔ)充培養(yǎng)基。對(duì)于INS-IE細(xì)胞，所述培養(yǎng)基 含有ImM丙酮酸鈉 、IOmM HEPES、和50μΜβ-巰基乙醇。于37°C，用或不用Τρ12抑制劑 (3 μ Μ)和毒蜥外泌肽-4 (20ηΜ)預(yù)孵育INS-IE細(xì)胞、小鼠胰島（每種條件下5-10個(gè)胰 島）或人胰島（每種條件下500-2000個(gè)IEQ) 2小時(shí)，然后用或不用Τρ12抑制劑（3 μ Μ)、 單獨(dú)的IL-I Ml〇〇〇〇U/ml，20ng/ml)、細(xì)胞因子混合物（對(duì)于INS-IE細(xì)胞和小鼠胰島為 IL-Iβ (100U/ml，0· 2ng/ml)、TNF- a (500U/ml，50ng/ml)、和 IFN-γ (100U/ml，30ng/ml)， 對(duì)于人胰島為 IL-I β (1000U/ml，2ng/ml)、TNF-a (l〇〇〇U/ml，28ng/ml)、和 IFN-γ (1000U/ ml，833ng/ml))、和毒蜥外泌肽-4(20ηΜ)，孵育INS-IE細(xì)胞、小鼠胰島或人胰島不同的時(shí)間 (0、8、16、24、36、48或72小時(shí)）。在蒙彼利埃的糖尿病細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室（研究生物治療研 究所，蒙彼利埃）進(jìn)行對(duì)于人胰島的所有實(shí)驗(yàn)。
[0256] 蛋白印跡：按照實(shí)驗(yàn)，INS-IE細(xì)胞、小鼠（每種條件下200-300個(gè)胰島）或大鼠 (每種條件下300-500個(gè)胰島）胰島用冷PBS洗滌一次，并溶解在冷裂解緩沖液中（對(duì)于 INS-IE 細(xì)胞為 50mM HEPES，ImM EDTA，ImM 苯甲基磺酰氟（PMSF)，ImM Na3VO4, IOmM 焦磷酸 鹽，IOOmM NaF，1% Triton X-100,0. 1% SDS和lmg/ml桿菌肽；對(duì)于小鼠和人胰島為50mM HEPES，4mM EDTA，ImM PMSF，ImM Na3VO4, IOmM焦磷酸鹽，IOOmM NaF，l % Nonidet P-40，lmg/ ml亮肽素，lmg/ml抑肽酶）。為了更好地溶解，添加裂解緩沖液和超聲之前，將胰島冷凍于 液氮中。然后通過(guò)離心（4°C，13000rpm，30分鐘）使細(xì)胞或胰島溶解產(chǎn)物澄清，使用BCA 方法確定蛋白濃度。通過(guò)在Laemmli樣品緩沖液中煮沸5分鐘使蛋白變性，并通過(guò)10或 12. 5% SDS-PAGE分離等量蛋白（15-30 μ g蛋白/泳道），并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。室 溫（RT)阻斷1小時(shí)后，用特定初級(jí)抗體（1:250至1:4000稀釋度）將膜于4°C孵育過(guò)夜，然 后用辣根過(guò)氧化物酶連接的第二抗體（1:2000)于RT孵育1小時(shí)。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢 測(cè)使蛋白顯像。數(shù)字化放射自顯影，使用ImageJ軟件（國(guó)立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)，MD)分 析條帶強(qiáng)度。
[0257] 細(xì)胞和胰島生存力：通過(guò)蛋白印跡評(píng)估，半胱天冬酶-3的17kDa裂解形式（其對(duì) 應(yīng)于半胱天冬酶-3的活化的預(yù)凋亡形式）的出現(xiàn)，以及DNA修復(fù)和細(xì)胞存活中涉及的核酶 聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP)的89kDa裂解形式的出現(xiàn)，來(lái)考察凋亡的INS-IE細(xì)胞的存 在。通過(guò)使用"半脫天冬酶-GtoS)..3/7Assay"（Promega Corp. Madison，Wisc.，USA)，根據(jù)制 造商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定半胱天冬酶-3/7活性來(lái)評(píng)價(jià)小鼠胰島的凋亡。該試劑盒基于由半胱天 冬酶3和7裂解發(fā)光底物的DEVD序列而產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。簡(jiǎn)言之，在96孔板中孵育胰島24 小時(shí)后（每孔大約相等尺寸的10個(gè)胰島）加入半胱天冬酶3/7-Glo試劑，并且于37°C孵育 樣品2小時(shí)。使用TECAN無(wú)限200平板閱讀器測(cè)量發(fā)光。
[0258] 胰島素分泌測(cè)定：在RPMI中用或不用Tpl2抑制劑和細(xì)胞因子孵育72小時(shí)后， 于37°C預(yù)孵育人分離的胰島（每種條件下3X5個(gè)人胰島當(dāng)量（IEQ)) 1小時(shí)，以穩(wěn)定于含 有 2. 8mM 葡萄糖的 KRB 緩沖液（24mM NaHCO3,120mM NaCl，4. 7mM KC1，I. 2mM KH2PO4,1. 2mM MgS04,2. 5mM CaCl2，和 IOmM HEPES，pH7. 4,0. 1% BSA)中，然后于 2. 8mM 孵育 I 小時(shí)并在 20mM葡萄糖中另外孵育1小時(shí)。收集等分的孵育緩沖液，通過(guò)離心使其澄清，并冷凍。通 過(guò)乙醇酸進(jìn)行總胰島胰島素含量的提取，隨后進(jìn)行超聲。通過(guò)放射免疫法（Milipore，SAS FRANCE)，按照制造商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量胰島素釋放和含量，并將刺激指數(shù)定義為被刺激的胰島 素分泌相比于基礎(chǔ)胰島素分泌的比例（ng/ml/胰島/小時(shí)），并通過(guò)胰島素含量（ng/ml/胰 島）校正該指數(shù)
[0259] 統(tǒng)計(jì)分析：所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立地重復(fù)至少三次。結(jié)果表示為N個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 土SEM。平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)非配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)評(píng)估，或通過(guò)ANOVA和隨后的 Newman-Keuls 或 Bonferroni post-hoc 分析評(píng)估。用 GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行分析。P 值〈0· 05 被認(rèn)為是顯著性。*，Ρ〈0· 05, #，Ρ〈0· 01，*#，Ρ〈0· 001。
[0260] Τρ12的抑制降低了由炎性巨噬細(xì)胞分泌的生理細(xì)胞因子和趨化因子的細(xì)胞凋亡 作用：于37°C和5%C02/95%空氣氣氛下，將RAW264. 7巨噬細(xì)胞保持在含有5% (體積/體 積）熱滅活的胎牛血清和抗生素的DMEM中。將RAW264. 7巨噬細(xì)胞與LPS (脂多糖）（0. 5ng/ ml)孵育24小時(shí)，并將所得到的條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到用或不用Tpl2抑制劑（5 μ Μ)處理的 INS-IE細(xì)胞上。用對(duì)抗裂解的半胱天冬酶-3 (1:1000)或HSP90 (1:1000)的抗體使溶解產(chǎn) 物經(jīng)歷蛋白印跡。顯示了四個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性免疫印跡和定量。數(shù)據(jù)表示為裂解的半胱天冬 酶-3與HSP90蛋白量的比例，并表示為裂解的半胱天冬酶-3相比于不用Τρ12抑制劑處理 的對(duì)照培養(yǎng)基中的細(xì)胞中基礎(chǔ)的倍數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。*Ρ〈0. 05,對(duì)比對(duì)照細(xì)胞 的刺激效果。
[0261] Τρ12抑制降低了人胰島中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ERK1/2活化：分離人胰島，并在 含有10% SVF的CMRL培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-72小時(shí)用于恢復(fù)，用具有或不具有Τρ12抑制劑 (3μΜ)的KRBH緩沖液處理2小時(shí)，然后用或不用細(xì)胞因子混合物（IL-Ιβ (100U/ml)、 TNF-α (500U/ml)、和 IFNy (lOOU/ml))刺激 20 分鐘。用對(duì)抗磷酸化 ERK1/2(1:1000)或 b-肌動(dòng)蛋白（1:2000)的抗體使溶解產(chǎn)物經(jīng)歷蛋白印跡分析。顯示了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表 性免疫印跡和定量。數(shù)據(jù)表示為磷酸化ERK2與b-肌動(dòng)蛋白量的比例，并表示為相比于未 處理的胰島中的基礎(chǔ)的增加倍數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。*P〈0. 05,對(duì)比對(duì)照細(xì)胞的刺 激效果。
[0262]
[0263] Tpl2的表達(dá)和活化?？筎pl2抗體在INS-IE細(xì)胞、小鼠和人胰島中檢測(cè)到兩個(gè)58 和52kDa的條帶（圖1Α)，其對(duì)應(yīng)于已經(jīng)被描述產(chǎn)生于可替換的翻譯起始位點(diǎn)（Aoki等人， 1993)的Tpl2的長(zhǎng)（Tpl2j和短（Tpl2s)同種型。相比于Tpl2s，Tpl2^被發(fā)現(xiàn)優(yōu)先表達(dá)于 INS-IE細(xì)胞、小鼠和人胰島（圖1A)。本發(fā)明人通過(guò)評(píng)價(jià)與其活化已顯示密切相關(guān)的降解 (Vougioukalaki等人，2011 ;Gantke等人，2011)考察了 Tpl2是由ILlP激活還是由三種 細(xì)胞因子（IL-Ιβ、TNF-a、IFN-y)的混合物激活。蛋白印跡分析揭示IL-Ιβ和細(xì)胞因子 混合物的刺激降低了 Tpl^帶位移，可能指示Tpl2 Ji舞酸化（見(jiàn)刺激5-10分鐘），并在處理 20分鐘后顯著降低了總Τρ12蛋白表達(dá)并持續(xù)至少30分鐘（圖IB和1C)。尤其地，TplA 是優(yōu)先被磷酸化和降解的（圖IB和1C)。
[0264] Τρ12在ERK1/2活化中的作用。為了研究β細(xì)胞中Τρ12的生物學(xué)，需要一種工具 化合物，在所設(shè)計(jì)的Τρ12抑制劑中，本發(fā)明人使用了來(lái)自Calbiochem(網(wǎng)站：http://www. millipore. com/catalogue/item/616373-lmg)的 Tpl2 抑制劑。該 Tpl2 抑制劑以 3μ M 濃度使用，因?yàn)橐阎? μ M以下的濃度顯示對(duì)于其他相關(guān)激酶例如|^1(、11(2、3代、蛋白激酶 C、和EGF受體的顯著選擇性。在防止ERK1/2級(jí)聯(lián)活化的濃度（〈5 μ Μ)下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他被 Τρ12抑制劑抑制或活化的蛋白激酶。如圖2Α所示，當(dāng)在3 μ M使用時(shí)，Τρ12抑制劑抑制 INS-IE細(xì)胞中約60%的IL-I β誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，這表明IL-I β刺激的ERK1/2磷酸 化需要Tpl2的活化。p90核糖體S6激酶（p90RSK)(已知其位于ERK1/2的下游）被相同程 度的抑制（圖2A)。3 μ M的濃度或甚至1〇 μ M的高濃度（數(shù)據(jù)未顯示）對(duì)于IL-I β誘 導(dǎo)的p46/p54c-Jun N-末端激酶（JNK)和ρ38磷酸化沒(méi)有作用的事實(shí)（圖2Β)表明Τρ12 抑制劑處理的特異性。Τρ12抑制劑的處理對(duì)于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化的50-60% 的抑制進(jìn)一步表明細(xì)胞因子刺激的ERK1/2磷酸化同樣需要Τρ12活化（圖2C)。由細(xì)胞因 子誘導(dǎo)的P90RSK磷酸化被相同程度的抑制（圖2C)。
[0265] 他們采取了 siRNA敲除戰(zhàn)略，以沉默INS-IE細(xì)胞中Τρ12蛋白的表達(dá)。正如圖2D 所示，與對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染INS-IE細(xì)胞相比，在Tpl2siRNA轉(zhuǎn)染INS-IE細(xì)胞中，50%減少的 Tpl2(Tpl2jPTpl2s)蛋白表達(dá)抑制了約50%的由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。p38的 磷酸化在這些條件下沒(méi)有受到影響（圖2D)。使用藥理學(xué)抑制或siRNA失效，這些結(jié)果表 明，通過(guò)Tpl2的基礎(chǔ)細(xì)胞表達(dá)，由INS-IE細(xì)胞中的急性IL-I β和細(xì)胞因子的刺激激活的 主要通路是一種產(chǎn)生ERK1/2的通路。
[0266] 重要地，INS-IE細(xì)胞的Τρ12抑制劑處理（圖3Α)和Tpl2siRNA轉(zhuǎn)染（圖3Β)均 沒(méi)有修飾葡萄糖誘導(dǎo)的ERK1/2和p90RSK磷酸化（其被描述在葡萄糖介導(dǎo)的β細(xì)胞存活 中起關(guān)鍵作用（Costes等人，2006))?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Τρ12參與對(duì)炎性刺激特異性反 應(yīng)的ERK1/2的活化。此外，相比于IL-I β或細(xì)胞因子的刺激（圖IB和1C)，葡萄糖沒(méi)有減 少總Τρ12蛋白表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示），這表明葡萄糖不能激活β細(xì)胞中的Τρ12。
[0267] 為了在多個(gè)生理模型中確認(rèn)，Τρ12參與INS-IE細(xì)胞中證實(shí)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 ERK1/2磷酸化，他們使用從C57BL/6小鼠中分離的胰島。用細(xì)胞因子處理胰島刺激ERK1/2 和P90RSK磷酸化（圖3C)。在抑制ERK1/2和p90RSK磷酸化中Τρ12抑制劑處理是有效的 (圖 3C)。
[0268] 慢性細(xì)胞因子的處理增加了 Τρ12的表達(dá)和在來(lái)自于2型糖尿病的動(dòng)物模型的胰 島中Τρ12的表達(dá)是增加的。當(dāng)用IL-I β或細(xì)胞因子混合物的急性處理（20-30分鐘）誘導(dǎo) Τρ12降解（圖IB和1C)時(shí)，長(zhǎng)期暴露于E-I β或細(xì)胞因子（8至24小時(shí)）增加了 INS-IE 細(xì)胞中Tpl2jP Tpl2 s的蛋白表達(dá)約2至3倍（圖4Α和4Β)。作為對(duì)照，β肌動(dòng)蛋白的蛋 白水平?jīng)]有受到影響（數(shù)據(jù)未顯示）?？蓹z測(cè)的裂解的半胱天冬酶-3和裂解的PARP出現(xiàn) 之前，IL-I β或細(xì)胞因子顯著增加了 Tpl2jP Tpl2 s水平（圖4Α和4Β)。24至48小時(shí)之 間細(xì)胞因子的長(zhǎng)期處理進(jìn)一步增加了 Tpl2jP Tpl2 s的蛋白表達(dá)約5倍（圖4B)。
[0269] 本發(fā)明人接下來(lái)確定致糖尿病的環(huán)境（高血糖和炎癥）是否會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)Tpl2蛋 白的上調(diào)。他們使用GK大鼠模型，自發(fā)型2型糖尿病的最佳表征動(dòng)物模型之一（Portha等 人，2009)。GK大鼠顯示高血糖，并且GK大鼠胰島特征增加了幾種炎癥標(biāo)記物包括IL-I β 的表達(dá)和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（Ehses等，2009年）。如圖4C所示，與對(duì)照正常Wistar大鼠相比， 在從GK大鼠分離的胰島中發(fā)現(xiàn)Tpl2jP Tpl2 s的蛋白表達(dá)分別顯著增加約2和2. 5倍，這 表明致糖尿病環(huán)境導(dǎo)致體內(nèi)Tpl2蛋白的上調(diào)。
[0270] 也在人胰島中評(píng)價(jià)Τρ12蛋白表達(dá)的水平。如圖4D所示，慢性細(xì)胞因子處理（72 小時(shí)）顯著增加人胰島中Tpl2jP Tpl2 s的蛋白表達(dá)1. 5和2倍。
[0271] Tpl2的抑制減少了 INS-IE細(xì)胞和小鼠胰島中炎性細(xì)胞因子的細(xì)胞凋亡作用。他 們接下來(lái)通過(guò)測(cè)量裂解形式的半胱天冬酶-3和PARP (細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子和標(biāo)記物）的 水平，確定Tpl2抑制是否可以修飾IL-I β或細(xì)胞因子的有毒的促凋亡作用。如圖5A和5C 所示，用Tpl2抑制劑單獨(dú)長(zhǎng)期處理INS-IE細(xì)胞沒(méi)有增加 INS-IE細(xì)胞的凋亡。將INS-IE 細(xì)胞暴露于IL-I β >24小時(shí)的時(shí)間段導(dǎo)致顯著的細(xì)胞凋亡（圖4Α和圖5Α)。尤其地，在用 Τρ12抑制劑處理的INS-IE細(xì)胞中觀察到由IL-I β誘導(dǎo)的裂解的半胱天冬酶-3和裂解的 PARP水平的降低（分別約45和約30% )(圖5Α)。與先前發(fā)表的觀察結(jié)果完全一致，相比 于單獨(dú)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的水平，裂解的半胱天冬酶-3的水平被三種細(xì)胞因子的混合物大 幅度增加（圖5Β)。他們進(jìn)一步驗(yàn)證了 Τρ12抑制劑處理在降低這個(gè)大幅度的細(xì)胞凋亡水平 上是否也有效。有趣的是，在用Τρ12抑制劑處理的INS-IE細(xì)胞中觀察到由細(xì)胞因子混合物 誘導(dǎo)的裂解的半胱天冬酶-3和裂解的PARP水平的降低（分別約30和約25% )(圖5C)。
[0272] 進(jìn)一步在分離的小鼠胰島中，考察了 Τρ12潛在參與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。尤 其地，用Τρ12抑制劑處理的胰島降低約50%的由細(xì)胞因子混合物誘導(dǎo)的裂解的半胱天冬 酶-3/7活性的水平（圖OT)。
[0273] Tpl2的抑制減少了由炎性巨噬細(xì)胞分泌的生理細(xì)胞因子和趨化因子的細(xì)胞凋亡 作用。為了確定Τρ12的抑制是否能夠保護(hù)胰腺β細(xì)胞免于由更多的生理細(xì)胞因子混合物 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，用LPS(脂多糖）激活巨噬細(xì)胞譜系RAW264.7。在這種含有數(shù)種由活化的 巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-I β、TNF_ α和IL-6的條件培養(yǎng)基存在下培養(yǎng) INS-IE細(xì)胞。在這種條件培養(yǎng)基中，Τρ12的藥理學(xué)抑制降低約55%的由24小時(shí)的INS-IE 細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)的裂解的半胱天冬酶-3的水平（圖6)。
[0274] Τρ12的抑制降低了人胰島中由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ERK1/2的活化：我們證實(shí)，用Τρ12 抑制劑處理人胰島，在抑制由細(xì)胞因子混合物誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化/活化方面顯著有效。 這些結(jié)果顯示人胰島中細(xì)胞因子刺激的ERK1/2信號(hào)通路的磷酸化需要Τρ12活化（圖7)。
[0275] 實(shí)施例2 :體內(nèi)Tp 12激酶的抑制減慢DB/DB小鼠中2型糖尿病的進(jìn)展。前驅(qū)糖尿 病和糖尿病db/db小鼠中葡萄糖穩(wěn)態(tài)的改善伴有空腹血糖、空腹胰島素血癥的顯著降低以 及胰島素敏感性的改善。
[0276] 材料與方法
[0277] 五周齡db/db小鼠獲得自Janvier Ltd，并在整個(gè)研究過(guò)程中用標(biāo)準(zhǔn)飲食（4%脂 肪）喂養(yǎng)。所有小鼠自由獲取食物和新鮮水并保持在12小時(shí)白天/12小時(shí)黑夜循環(huán)。在腹 腔內(nèi)（ip)施用葡萄糖、胰島素或每日注射2. 5mg/kg Tpl2抑制劑和對(duì)應(yīng)的載體之前直至處 死當(dāng)日記錄體重。16小時(shí)過(guò)夜禁食后通過(guò)ip施用l-2g/kg葡萄糖進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)，使 用來(lái)自尾靜脈的血液樣品，用（Verio Onetouch，Lifescan，Johnson and Johnson Company) 血糖儀測(cè)定血糖濃度。按照向非禁食的小鼠 ip施用0. 75U胰島素/kg體重，以類似的方式 進(jìn)行胰島素耐受性試驗(yàn)。使用在研究的第一天來(lái)自尾靜脈或處死當(dāng)日來(lái)自頸動(dòng)脈的血液樣 品，通過(guò)放射免疫測(cè)定（RIA大鼠胰島素試劑盒，Millipore)定量血清胰島素水平。
[0278] 結(jié)果
[0279] 在db/db小鼠中觀察到的2型糖尿病的前進(jìn)發(fā)展伴隨增加的體重、胰島素抵抗、高 血糖癥和受損的葡萄糖耐量。因此，為了確定Tpl2抑制是否具有預(yù)防和/或治療2型糖尿 病的潛能，我們使用6周齡的db/+和db/db小鼠，分為3組（每日ip注射2. 5mg/kg Τρ12 抑制劑或?qū)?yīng)的載體），經(jīng)過(guò)2周研究，監(jiān)視這些生理參數(shù)。
[0280] 在6周齡db/db小鼠中，初始體重和空腹胰島素水平顯著高于db/+動(dòng)物（圖8和 9)。相反地，各組之間的空腹血糖濃度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明6周齡db/db小鼠在研究 開(kāi)始之前已經(jīng)發(fā)展為高胰島素血癥但不是糖尿病。因此，在首次ip注射之前2天，相比于 db/+動(dòng)物，6周齡db/db小鼠中2g/kg葡萄糖耐量挑戰(zhàn)受損（圖10)。重要地，體重、葡萄糖 耐量、空腹血糖和胰島素水平在2組db/db小鼠之間相似。
[0281] 令人該興趣的是，在7天處理之后，Tpl2激酶抑制劑注射的db/db小鼠中，已經(jīng)顯 著改善葡萄糖耐量挑戰(zhàn)（圖10B)。這種對(duì)葡萄糖耐量的改善也伴隨如第14天觀察到的顯 著減少的空腹血糖和血清胰島素水平（圖9)。因此，在用Tpl2激酶抑制劑處理db/db小 鼠中，空腹血糖濃度和血清胰島素水平分別從258. 6+40. 7mg/dL和11. 3±1. 2ng/ml降低 至144. 0+15. 5mg/dL和4. 3±0. 4ng/ml (圖9)。此外，如胰島素耐受性試驗(yàn)中所評(píng)估的，施 用載體的db/db小鼠顯示顯著降低的血糖中胰島素依賴性的降低，這與db/db動(dòng)物中胰島 素抵抗的發(fā)展相一致。在用Tpl2激酶抑制劑處理14天后，我們觀察到胰島素敏感性的顯 著改善（圖10C)。最后，在處理2周后，在所有組中，總的體重均顯著增加，相比于db/+動(dòng) 物，這些增加在db/db小鼠中更明顯（圖8)。更重要的是，在載體和Tpl2激酶抑制劑處理 的db/db小鼠之間體重?zé)o差別，這表明在考察的2周期間，每日ip施用2. 5mg/kg Τρ12激 酶抑制劑沒(méi)有毒性（圖8)。
[0282] 體內(nèi)研究的關(guān)鍵問(wèn)題的總結(jié)
[0283] 前驅(qū)糖尿病和糖尿病db/db小鼠中葡萄糖穩(wěn)態(tài)的改善伴有空腹血糖、空腹胰島素 血癥的顯著降低以及胰島素敏感性的改善。
[0284] -對(duì)體重沒(méi)有影響
[0285] -db/db小鼠中葡萄糖耐量的改善
[0286] -空腹高血糖的改善（該觀察結(jié)果使得我們?cè)O(shè)想：通過(guò)降低血液血糖Tpl2抑制可 以減少微血管和大血管并發(fā)癥、心血管危險(xiǎn)因素、降低患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)、并改善與長(zhǎng)壽相關(guān)的 標(biāo)記物）。
[0287] -血漿胰島素血癥的改善
[0288] -胰島素敏感性的改善
[0289] 實(shí)施例3 :用于預(yù)防或治療糖尿病的Τρ12激酶抑制劑和GPL-I激動(dòng)劑（毒蜥外泌 肽-4)的組合
[0290] 材料與方法
[0291] 材料與方法之前已經(jīng)描述（特別是在"藥物暴露"部分，其中公開(kāi)了 Τρ12抑制劑 和毒蜥外泌肽-4的組合處理）。
[0292] MM.
[0293] Τρ12抑制劑和GLP-I類似物的組合對(duì)INS-IE細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的抗凋亡作用。 臨床前和臨床研究表明，GLP-I受體激動(dòng)劑（如毒蜥外泌肽-4)具有適度的抗炎作用 (Pugazhenthi等人，2010)。為了驗(yàn)證同時(shí)抑制Τρ12是否可以體外改善GLP-I激動(dòng)劑對(duì)β 細(xì)胞存活的有益效果，首先考察Τρ12抑制劑單獨(dú)、毒蜥外泌肽-4單獨(dú)或Τρ12抑制劑/毒 蜥外泌肽-4的組合對(duì)細(xì)胞因子有害作用下的INS-IE細(xì)胞的效果。重要地，Τρ12和毒蜥外 泌肽-4治療的藥理學(xué)抑制的組合相比于單獨(dú)的各個(gè)化合物對(duì)INS-IE細(xì)胞產(chǎn)生更有力的抗 凋亡作用（圖11)。
[0294] Τρ12抑制劑和GLP-I類似物的組合保護(hù)人胰島免于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島素分泌 失敗。β細(xì)胞的慢性細(xì)胞因子暴露不僅惡化β細(xì)胞存活而且惡化胰島素分泌（Donath等 人，2011)。基于INS-IE和小鼠胰島中觀察到的Tpl2失活的顯著抗炎作用，本發(fā)明人最終 證實(shí)Τρ12的失活是否可以阻止人胰島中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島素分泌失敗。在存在或不存 在細(xì)胞因子下，將人胰島暴露于含有5. 5mM葡萄糖的培養(yǎng)基中。
[0295] 他們觀察到，在人胰島暴露于細(xì)胞因子混合物72小時(shí)中，對(duì)葡萄糖反應(yīng)的胰島素 分泌（圖中的刺激指數(shù)）被顯著降低約40-50% (圖12)。他們進(jìn)一步考察用Tpl2抑制劑 治療人類胰島是否保護(hù)它們免于胰島素分泌功能障礙。他們觀察到，用非細(xì)胞毒性濃度的 Τρ12抑制劑處理人胰島顯著防止細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島素分泌失敗約50% (圖12)，這表明 用Τρ12抑制劑處理的人胰島是更可行的和功能性的，并被保護(hù)（但部分地）免于炎性細(xì)胞 因子混合物的有害作用。
[0296] 重要地，Τρ12抑制劑和毒蜥外泌肽-4治療的組合完全防止細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島 素分泌失敗（圖7)，這表明用Τρ12抑制劑和毒蜥外泌肽-4的組合處理人胰島是可行的和 功能性的，而且完全被保護(hù)免于細(xì)胞因子對(duì)β細(xì)胞葡萄糖傳感和胰島素分泌的有害影響。
[0297] 實(shí)施例4 :用于預(yù)防或治療糖尿病的Τρ12激酶抑制劑和GPL-I激動(dòng)劑（利拉魯肽） 的組合。Τρ12抑制劑和GLP-I類似物，利拉魯肽的組合可以保護(hù)INS-IE細(xì)胞免于細(xì)胞因子 誘導(dǎo)的凋亡。
[0298] 材料與方法
[0299] 在含有7. 5% SVF的RPMI培養(yǎng)基中，用或不用Τρ12抑制劑（3 μ Μ)和/或利拉魯 肽（20ηΜ)處理INS-IE β細(xì)胞