>[0059] 二級不良反應(yīng)："+"=弱陽性反應(yīng)（紅斑反應(yīng)）：紅斑、浸潤、水腫、可有丘疹；
[0060]S級不良反應(yīng)："++"=強(qiáng)陽性反應(yīng)（瘤疹反應(yīng)）：紅斑、浸潤、水腫、丘疹、瘤疹，反 應(yīng)可超出受試區(qū)；
[0061] 四級不良反應(yīng)："+++"=極強(qiáng)陽性反應(yīng)（融合性瘤疹反應(yīng)）：明顯紅斑、嚴(yán)重浸潤、 水腫、融合性瘤疹，反應(yīng)超出受試區(qū)。
[0062] 根據(jù)化妝品衛(wèi)生規(guī)范2007,人體斑貼試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)為：30例受試者中出現(xiàn)1級皮 膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于5例，或二級皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于2例，或出現(xiàn)任何1例=級或 S級W上皮膚不良反應(yīng)時，則判定受試物對人體有不良反應(yīng)，反之，則視為對人體無不良反 應(yīng)。
[0063] 從表1中可W看出：實(shí)施例1得到的玫瑰發(fā)酵原漿產(chǎn)生1例可疑反應(yīng)，且在24h 后，該例可疑反應(yīng)消失，說明本發(fā)明提供的玫瑰發(fā)酵物均具有安全性，不會給人體帶來不良 反應(yīng)。 W64] 表1、實(shí)施例1獲得的玫瑰發(fā)酵原漿的斑貼試驗(yàn)結(jié)果 陽0化]
[0066]=、玫瑰發(fā)酵原漿的分子量大小檢測：
[0067] 分子量大小是檢驗(yàn)是否能夠進(jìn)行皮膚滲透的重要因素。本發(fā)明通過高效液相色譜 (HPLC)測定實(shí)施例1制備的玫瑰發(fā)酵原漿的分子量大小。具體步驟如下： W側(cè) 1、試驗(yàn)的試劑和溶液的制備： W例 （1)流動相：乙臘冰：S氣乙酸=30 :70 :0. 1 (v/v/v)。 W70] 0)樣品制備：W流動相為溶劑配制濃度為5mg/ml的樣品，再在用微孔膜 (0. 45ym)過濾后供進(jìn)樣。
[0071] (3)標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：將牛血清蛋白（Mw67000)、維生素Bi2(Mw1335)、氧化型谷脫 甘膚（Mw614)配成混標(biāo)，每種物質(zhì)的濃度均為5mg/ml。
[0072] 2、試驗(yàn)方法： 陽07引將立種已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品：牛血清白蛋白（Mw67000)，維生素Bi2(Mw133W和 氧化型谷脫甘膚（Mw614)通過高效液相色譜儀（Waters公司）參照文獻(xiàn)"王成忠等.蛋白 酶酶解麥胚蛋白及酶解液中多膚分子量分布的研究.糧食加工，2012:37 (2)"中的方法進(jìn) 行HPLC分析，繪制分子量對數(shù)與洗脫時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)凝膠柱滲透層析原理，多膚分 子量大的物質(zhì)先被洗脫出來，洗脫時間與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。再按照同樣的方法將 實(shí)施例1中制備的玫瑰發(fā)酵原漿進(jìn)行HPLC分析，得到相應(yīng)峰的洗脫時間，將洗脫時間代入 標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到實(shí)施例1制備的玫瑰發(fā)酵原漿的分子量大小。
[0074]色譜條件：色譜柱：TsKgel2000SWXL300mmX7. 8mm;檢測波長：UV280nm;流 速：lml/min;柱溫：30°C。 陽0巧]3、試驗(yàn)結(jié)果：
[0076] 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子量與洗脫時間如下表2所示，根據(jù)分子量的對數(shù)和洗脫時間做圖 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= -2. 4738X+17. 656，R2= 0. 9998。其中y為洗脫時間（min) ;x為分子量 對數(shù)。
[0077] 表2、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子量與洗脫時間
[0078]
[0079] 實(shí)驗(yàn)組1制備的玫瑰發(fā)酵原漿的HPLC圖譜如圖1所示：從圖1中可W看出：玫瑰 發(fā)酵原漿的圖譜中主要包括1個組分峰，洗脫時間為11. 69min，將洗脫時間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線： y= -2. 4738X+17. 656,計算出峰的分子量為259. 23化，并且根據(jù)峰面積計算玫瑰發(fā)酵原漿 占96. 85%。一般認(rèn)為分子量為500Da左右的活性膚成分更易被皮膚吸收，所W玫瑰發(fā)酵物 中存在容易被吸收的活性多膚。
[0080] 四、玫瑰發(fā)酵原漿的抗氧化性能檢測：
[0081] DPPH是一種早期合成的有機(jī)自由基，常用來評估抗氧化物的供氨能力，它在有 機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，而且在517nm處有一個特征吸收峰，當(dāng)遇到自由基清除劑時， DPPH的孤對電子被配對而使其退色，也就是在最大吸收波長處的吸光值變小。因此，可通過 測定吸光值的變化來評價樣品對DPPH自由基的清除效果。
[0082] 取不同量的實(shí)施例1制備得到的玫瑰發(fā)酵原漿溶于去離子水中，制得0.63%、 1. 25%、2. 5%、5%和10%體積百分含量的玫瑰發(fā)酵原漿待測液。
[0083] DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)步驟為：
[0084] (1)取等體積（一般為3mL)的待測液與2X10 4mol/L的DPPH溶液混勻（Ai管）； 陽0財 似取等體積的無水乙醇（待測物溶劑）與2X10 4mol/L的DPPH溶液混勻（Az 管）；
[0086] 做取等體積的無水乙醇與待測液混勻（As管）；
[0087] (4)反應(yīng)30min后，在517nm下測Ai、A2、A3管吸光度值。
[0088] 清除率計算公式為：清除率（％ ) = [(A2+A3)-Ai]/A2
[0089] W玫瑰發(fā)酵原漿待測液的體積百分含量為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，做出玫瑰發(fā) 酵原漿待測液對DPPH自由基清除作用曲線，見圖2。
[0090] 由圖2可知：所得玫瑰發(fā)酵原漿對DPPH清除作用的IC50 = 0. 56 %，說明玫瑰發(fā) 酵原漿具有較強(qiáng)的抗氧化能力可清除自由基，促進(jìn)細(xì)胞代謝，增強(qiáng)細(xì)胞活力，改善機(jī)體的結(jié) 構(gòu)和功能，提高機(jī)體生命力，從而延緩細(xì)胞老化，發(fā)揮其抗衰老的作用。
[0091] 五、玫瑰發(fā)酵原漿的美白功效分析：
[0092] 酪氨酸酶是黑素生成的關(guān)鍵酶，它控制著黑素的形成過程，其活性程度對色素的 沉積起主要作用。目前市場上銷售的許多美白、桂斑產(chǎn)品都是W抑制酪氨酸酶達(dá)到美白作 用，故對酪氨酸酶抑制作用的強(qiáng)弱是評價增白化妝品的主要指標(biāo)。
[0093] 通過測定樣品對酪氨酸酶的影響來評價樣品的美白功能，W10%玫瑰發(fā)酵原漿 (將實(shí)施例1所得玫瑰發(fā)酵原漿采用去離子水稀釋至體積百分含量為10% )為待測樣品， 測定其對酪氨酸酶活性的抑制效果。
[0094]具體方法如下； 陽0巧]按表3配置溶液：
[0096] 表3、溶液配制列表
[0097]
陽〇98] 注：Cl和T1加入1血酪氨酸酶，酶活為lOOU/mL。
[0099] (1侶管配好搖勻后，在37°C水浴鍋中水浴加熱lOmin，波長475nm下調(diào)零。
[0100] 似Cl管溶液配好搖勻，37°C水浴lOmin后，加酪氨酸酶1ml，繼續(xù)水浴lOmin，測定 。吸光度值。 陽101] 做按（1)似同樣方法，WT2調(diào)零測定T1吸光度值。 陽10引 （4)計算樣品對酪氨酸酶的活性抑制率T(%)。T(%) =(Ci-Ti)/CiX100%
[0103] 實(shí)驗(yàn)證明10%玫瑰發(fā)酵原漿對酪氨酸酶活性的抑制率為65. 42%，1%的熊果巧 對酪氨酸酶活性的抑制率99. 52%，見圖3,從圖3可得知：玫瑰發(fā)酵原漿的美白效果相當(dāng)于 0.657%的熊果巧的效果，具有一定的美白功效。
【主權(quán)項】
1. 一種玫瑰發(fā)酵原漿的制備方法，包括如下步驟：將玫瑰干粉、水和發(fā)酵菌混合得到 初始體系，并對初始體系進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到玫瑰發(fā)酵原漿。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述發(fā)酵菌、所述玫瑰干粉和水的配比 為（15-25)ml :(7-15) g :350g，所述發(fā)酵菌濃度為 IO5-IOsCFlVml。3. 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25-38°C， 時間為24-32h。4. 如權(quán)利要求1-3中任一項所述的制備方法，其特征在于：所述發(fā)酵菌為酵母菌，具體 為巴氏酉孝母菌 Saccharomyces pastorianus ; 所述玫瑰干粉取自玫瑰花干花蕾。5. 如權(quán)利要求1-4中任一項所述的制備方法，其特征在于：所述玫瑰干粉的目數(shù)為 20-50 目。6. 如權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備方法，其特征在于：上述制備方法中，還包括對 所述發(fā)酵培養(yǎng)后所得發(fā)酵液依次進(jìn)行滅菌、離心、取上清液的步驟。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述滅菌的條件如下：滅菌溫度為 115-121 °C，滅菌時間為 15-25min ; 所述離心的條件如下：離心轉(zhuǎn)速為3800-4200r/min、離心時間為15_30min，離心半徑 為 9cm〇8. 權(quán)利要求1-7中任一項所述的制備方法而得到的玫瑰發(fā)酵原漿。9. 權(quán)利要求8所述的玫瑰發(fā)酵原漿在制備具有下述至少一種功能的化妝品中的應(yīng)用 或在直接作為具有下述至少一種功能的化妝品中的應(yīng)用： 1)美白；2)抗衰老；3)清除DPPH自由基；4)抑制酪氨酸酶。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述化妝品為面膜、精華液或爽膚水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玫瑰發(fā)酵原漿及其制備方法與應(yīng)用。其制備方法包括如下步驟：將玫瑰干粉、水和酵母菌混合得到初始體系，并對初始體系進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到玫瑰發(fā)酵原漿，其中，所用的酵母菌為巴氏酵母。玫瑰發(fā)酵原漿化妝品不含任何化學(xué)成分，且不需要添加酶等外來物質(zhì)，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本，而且最大化的簡化了生產(chǎn)步驟，使該發(fā)酵技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)大量生產(chǎn)、工業(yè)化生產(chǎn)，并能夠充分保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。同時，可以直接作為面膜或精華液或爽膚水的成品使用，比現(xiàn)有市面上的其他產(chǎn)品更加天然，不會給肌膚造成任何負(fù)作用；本發(fā)明能獲得小分子量多肽，易于讓皮膚充分吸收。能廣泛用于制備具有美白和/或抗衰老的產(chǎn)品中。
【IPC分類】A61K8/99, A61K8/97, A61Q19/00, A61Q19/02, A61Q19/08
【公開號】CN105147586
【申請?zhí)枴緾N201510639300
【發(fā)明人】王昌濤, 李萌, 方國忠, 方曉薇, 趙丹, 張佳嬋, 王冬冬
【申請人】上海全麗生物科技有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月30日