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靶向真菌細(xì)胞壁多糖的抗體的制作方法

文檔序號:9437290閱讀:654來源:國知局
靶向真菌細(xì)胞壁多糖的抗體的制作方法
【專利說明】
【背景技術(shù)】
[0001]近年來侵襲性真菌疾病發(fā)病率的顯著上升,以及出現(xiàn)藥物抗性和之前罕見的真菌物種,突出了對于廣譜有效的新型治療和預(yù)防性抗真菌治療策略的需要(3-5)。侵襲性真菌感染的發(fā)病率增加可部分歸因于免疫受損的患者群體的增多,原因是與獲得性免疫缺陷有關(guān)的疾病的患者、重癥護(hù)理病房中的患者、進(jìn)行手術(shù)或免疫抑制性治療的患者和接受器官或細(xì)胞移植治療的患者的數(shù)量不斷增長。重要的是,使個體易患侵襲性真菌疾病的風(fēng)險因素不排除增強(qiáng)有效的免疫響應(yīng)和有利地響應(yīng)免疫治療的可能性(6,7),承諾開發(fā)有效的基于疫苗或免疫治療的途徑來滿足該未被滿足的醫(yī)學(xué)需要。
[0002]影響人類的兩種最普遍的病原性真菌-曲霉菌和念珠菌屬-占所有健康護(hù)理獲得性感染的約8-10%,造成的死亡率為30-40% (5,8)。念珠菌物種是美國醫(yī)院感染敗血癥的第四大原因,由所有病原性真菌導(dǎo)致的侵襲性真菌疾病的發(fā)病率上升帶來了全世界的顯著護(hù)理負(fù)擔(dān)。由于醫(yī)院獲得性真菌感染的停留和治療長度增加造成的過度護(hù)理成本僅在美國即為每年10億美元。此外,臨床分離物的綜合抗真菌易感性測試明顯得出,即使安全有效的抗真菌藥物取得進(jìn)展,但是對所有類別的當(dāng)前可獲得的抗真菌劑具有抗性菌株的出現(xiàn)
(5)。隱球菌性腦膜炎是被隱球菌屬真菌感染,也稱為隱球菌病,在晚期HIV/AIDS人群中是非常嚴(yán)重的機(jī)會性感染。隱球菌病不具有傳染性,意味著其不會人-人傳播。隱球菌性腦膜炎特別是在隱球菌從肺擴(kuò)散到腦后發(fā)生。作為世界上的全球問題,每年發(fā)生約1000000例隱球菌性腦膜炎新病例,導(dǎo)致625,000例死亡。許多病例是機(jī)會性感染,其出現(xiàn)在具有HIV/AIDS的人中。雖然在發(fā)達(dá)國家可廣泛獲得的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(ART)有助于在這些地區(qū)減少隱球菌感染,但在獲得護(hù)理受限的發(fā)展中國家這仍然是主要問題。例如在整個撒哈拉以南非洲的大多數(shù)地區(qū),隱球菌屬現(xiàn)在是成人腦膜炎的最常見原因。隱球菌性腦膜炎是HIV/AIDS患者中前列原因之一,在撒哈拉以南非洲,其可能每年導(dǎo)致與肺結(jié)核一樣多的人死亡
(24)。
[0003]抗擊真菌疾病的這些重大挑戰(zhàn)在于迫切需要高度有效的泛真菌疫苗作為抗真菌武器庫的有價值組分。迄今為止,已經(jīng)開發(fā)出兩種真菌細(xì)胞壁糖組分,甘露聚糖和β -葡聚糖,作為用于抗真菌接種的靶標(biāo)。由線性β - (I — 3)-葡聚糖或β - (I —2)-甘露三糖組成的結(jié)合疫苗已經(jīng)顯示賦予針對真菌疾病的保護(hù)性,在主動和被動性免疫中均具有功效(9-11)。在真菌疾病的動物模型中,β -葡聚糖疫苗證明針對白色念珠菌(C.albicans)、煙曲霉(A.fumigatus)和新型隱球菌(C.neoformans)有效,證實可以針對多種不同的真菌病原體進(jìn)行成功接種(9,12)。然而,產(chǎn)生有效的疫苗響應(yīng)需要仔細(xì)考慮靶抗原的精細(xì)結(jié)構(gòu),有確鑿證據(jù)表明真菌病原體使用的一種免疫逃避機(jī)制是表達(dá)誘導(dǎo)非保護(hù)性或抑制性抗體響應(yīng)的免疫顯性表位。這些誘餌表位消除了針對保護(hù)性表位的響應(yīng)的有效性。例如,由線性β-(1 — 3)-葡聚糖表位組成的疫苗產(chǎn)生保護(hù)性響應(yīng),而由具有β-(I — 6)-葡聚糖枝化物的β-(1 — 3)-葡聚糖組成的疫苗產(chǎn)生針對兩種結(jié)構(gòu)的抗體,但不賦予針對真菌疾病的保護(hù)性(13,14) ο
[0004]另外,疫苗的基礎(chǔ)有用性依賴于靶抗原的通用性。例如,β-(I —2)甘露三糖表位不在所有念珠菌屬物種中出現(xiàn),并且使用該表位的疫苗抗原依賴于保護(hù)性肽表位以擴(kuò)展其應(yīng)用(10)??紤]到一些細(xì)胞壁糖表位的有限分布,并且從真菌病原體逃避針對細(xì)胞壁組分產(chǎn)生的免疫響應(yīng)所使用的機(jī)制出發(fā),需要廣泛有效的真菌疫苗。本發(fā)明設(shè)計為靶向高度保守的真菌細(xì)胞壁糖表位以提供泛真菌疫苗(pan-fungal vaccine)。
[0005]尚未檢查甲殼素作為抗真菌疫苗的靶標(biāo),主要的原因在于其高度不溶的性質(zhì)。用于將甲殼素降解成可溶性片段的本領(lǐng)域可用的方法在化學(xué)計量上不受控,因此難以調(diào)節(jié)解聚合的程度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種包含一個或多個多糖部分的化合物,所述多糖部分各自獨立地由式β (I — 4)-[GlcNH-R]n-2,5-脫水甘露糖表示,其中η是3?500的正整數(shù),并且R是H
或?;?br>[0007]本發(fā)明還提供一種用于制造由式β (I — 4)-[GlcNH-R]n-2, 5_脫水甘露糖表示的化合物的方法,其中η是3?500的正整數(shù),所述方法包括:
[0008](a)使殼聚糖與足以將所述殼聚糖部分地N-?;牧康孽;瘎┓磻?yīng),產(chǎn)生改性甲殼素/殼聚糖混合聚合物;
[0009](b)使改性甲殼素/殼聚糖混合聚合物與脫氨基劑反應(yīng)以在未乙?;臍ぞ厶遣糠痔幥懈钏龌旌暇酆衔?,產(chǎn)生式β (I — 4)-[GlcNH-R]η-2,5-脫水甘露糖的化合物。
[0010]本發(fā)明提供一種使哺乳動物受試對象對真菌性感染或病原體免疫的方法,所述方法包括對所述受試對象施用致免疫量的所述化合物或包含該化合物的組合物。本發(fā)明提供一種在哺乳動物受試對象中刺激針對真菌病原體的免疫響應(yīng)的方法,所述方法包括對所述受試對象施用致免疫量的所述化合物或包含該化合物的組合物。本發(fā)明還提供對上述化合物具有特異性的抗體。并且還提供保護(hù)哺乳動物受試對象免于真菌感染或病原體的方法,所述方法包括對所述受試對象施用有效保護(hù)所述受試對象免受真菌感染的量的抗體。
【附圖說明】
[0011]圖1:用于制備改性甲殼素片段的反應(yīng)方案。
[0012]用于從殼聚糖一鍋制備改性甲殼素片段的反應(yīng)方案。
[0013]圖2:改性甲殼素與破傷風(fēng)類毒素綴合的分析。
[0014]考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠顯示改性甲殼素片段與破傷風(fēng)類毒素(TT)蛋白的
?雙口 ο
[0015]圖3:改性甲殼素-TT綴合物的給藥和免疫方案。
[0016]表格顯示用于對Balb/C小鼠施用改性甲殼素-TT綴合物疫苗的給藥和免疫方案。
[0017]圖4:Balb/C小鼠中改性甲殼素-TT綴合物疫苗的免疫原性。
[0018]線圖顯示Balb/C小鼠中改性甲殼素-TT疫苗綴合物的免疫原性。篩選中的抗原是與人血清白蛋白(HSA)交聯(lián)的改性甲殼素。
[0019]圖5A:在用改性甲殼素-TT疫苗綴合物免疫的Balb/C小鼠中免疫響應(yīng)的特異性。
[0020]線圖比較了與改性甲殼素-HSA篩選抗原結(jié)合的疫苗血清的抑制作用。
[0021]圖5B:在用改性甲殼素-TT疫苗綴合物免疫的Balb/C小鼠中的免疫響應(yīng)的特異性。
[0022]柱狀圖顯示疫苗血清缺乏針對多種含有糖綴合物的GIcNAc的交叉反應(yīng)性。
[0023]圖5C:在用改性甲殼素-TT疫苗綴合物免疫的Balb/C小鼠中的免疫響應(yīng)的特異性。
[0024]柱狀圖顯示疫苗血清針對甲殼素/殼聚糖多糖的反應(yīng)性。左側(cè)圖顯示,針對改性甲殼素具有反應(yīng)性的抗體可以由于吸附在特定甲殼素或殼聚糖上而減少。此外,來自甲殼素或殼聚糖的可溶性提取物抑制疫苗血清與改性甲殼素-HSA的結(jié)合。右側(cè)圖顯示,不相干抗體(抗-HA)與其表位的結(jié)合不受相同處理影響。
[0025]圖6:改性甲殼素-TT綴合物疫苗誘導(dǎo)的抗體與全白色念珠菌真菌的結(jié)合。
[0026]柱狀圖顯示來自空白對照(mock) (PBS)和改性甲殼素-TT免疫的Balb/C小鼠的血清抗體與全白色念珠菌結(jié)合。反應(yīng)性與改性甲殼素片段特異性競爭(competed awaywith)ο
[0027]圖6B:改性甲殼素-TT綴合物疫苗誘導(dǎo)的抗體與全白色念珠菌真菌的結(jié)合。
[0028]柱狀圖顯示抗原親和性純化的甲殼素反應(yīng)性抗體與全白色念珠菌真菌結(jié)合。
[0029]圖7A:在各種條件下生長的白色念珠菌酵母細(xì)胞的形態(tài)。
[0030]酵母細(xì)胞在30C在YPD培養(yǎng)基ο/η生長。
[0031]圖7Β:在各種條件下生長的白色念珠菌酵母細(xì)胞的形態(tài)。
[0032]在YPD培養(yǎng)基和血清中于37C生長150分鐘的中間體絲狀細(xì)胞。
[0033]圖7C:在各種條件下生長的白色念珠菌酵母細(xì)胞的形態(tài)。
[0034]在YPD培養(yǎng)基和血清中于37C生長300分鐘的絲狀物。
[0035]圖8Α:通過流式細(xì)胞術(shù)使改性甲殼素和海帶多糖疫苗誘導(dǎo)的抗體與全白色念珠菌結(jié)合。
[0036]用于抗體與酵母細(xì)胞結(jié)合的檢驗對照。
[0037]圖SB:通過流式細(xì)胞術(shù)使改性甲殼素和海帶多糖疫苗誘導(dǎo)的抗體與全白色念珠菌結(jié)合。
[0038]破傷風(fēng)類毒素抗體對照與酵母細(xì)胞的結(jié)合。
[0039]圖SC:通過流式細(xì)胞術(shù)使改性甲殼素和海帶多糖疫苗誘導(dǎo)的抗體與全白色念珠菌結(jié)合
[0040]海帶多糖抗體(上部)和改性甲殼素抗體(下部)與于30C在YPD培養(yǎng)基ο/η生長的酵母細(xì)胞的結(jié)合
[0041]圖8D:通過流式細(xì)胞術(shù)使改性甲殼素和海帶多糖疫苗誘導(dǎo)的抗體與全白色念珠菌結(jié)合。
[0042]海帶多糖與于37C在YPD培養(yǎng)基和血清中生長150分鐘的酵母細(xì)胞的結(jié)合。
[0043]圖8Ε:通過流式細(xì)胞術(shù)使改性甲殼素和海帶多糖疫苗誘導(dǎo)的抗體與全白色念珠菌結(jié)合。
[0044]改性甲殼素抗體與于37C在YPD培養(yǎng)基和血清中生長300分鐘的酵母細(xì)胞(菌絲)的結(jié)合。
[0045]圖9Α:改性甲殼素-TT疫苗介導(dǎo)的保護(hù)免受白色念珠菌的致死性挑戰(zhàn)(challenge)。
[0046]將小鼠(Balb/C)用改性甲殼素-TT疫苗免疫,隨后用致死劑量的活白色念珠菌挑戰(zhàn)。真菌挑戰(zhàn)后監(jiān)視存活36天。
[0047]圖9Β:改性甲殼素-TT疫苗介導(dǎo)的保護(hù)免受白色念珠菌的致死性挑戰(zhàn)。
[0048]將小鼠(CDl)用改性甲殼素-TT和海帶多糖-TT綴合物疫苗免疫,隨后用致死劑量的活白色念珠菌挑戰(zhàn)。真菌挑戰(zhàn)后監(jiān)視存活28天。
[0049]圖1OA:正常人血清與甲殼素、改性甲殼素和海帶多糖的通過ELISA進(jìn)行的免疫反應(yīng)性。
[0050]在改性甲殼素-HSA涂布板上的正常人血清(IgGy)的反應(yīng)性。所有血清都顯著地與改性甲殼素反應(yīng),表明:通過暴露至真菌或其他含甲殼素的外源抗原,在人體中存在天然獲得的甲殼素-特異性抗體。
[0051]圖10Β:正常人血清(NHS)與甲殼素、改性甲殼素和海帶多糖的通過ELISA進(jìn)行的免疫反應(yīng)性。
[0052]通過用各種抑制劑進(jìn)行競爭性抑制得出高滴度NHS與改性甲殼素-HSA涂布板的結(jié)合的抗體特異性。針對改性甲殼素的NHS特異性最高,然后是小甲殼素寡糖抑制劑(DP5和 DP3)ο
[0053]圖1OC:正常人血清與甲殼素、改性甲殼素和海帶多糖的通過ELISA進(jìn)行的免疫反應(yīng)性。
[0054]通過用DP增加的甲殼素寡糖進(jìn)行競爭性抑制得出高滴度NHS與殼六糖-HSA涂布板的結(jié)合的抗體特異性。隨著甲殼素寡糖的尺寸從DP2增加至DP6,抑制增加,表明這些人抗體識別最小尺寸為六糖的甲殼素的構(gòu)象表位。
[0055]圖1OD:正常人血清與甲殼素、改性甲殼素和海帶多糖的通過ELISA進(jìn)行的免疫反應(yīng)性。
[0056]在海帶多糖-HSA涂布板上的正常人血清(IgG γ )的反應(yīng)性。NHS識別海帶多糖(β葡聚糖)抗原,不過與改性甲殼素的程度不相同。
[0057]圖11:通過流式細(xì)胞術(shù)使改性甲殼素和海帶多糖疫苗誘導(dǎo)的抗體與全新型隱球菌A型(Η99)結(jié)合。
[0058]用于抗體與酵母細(xì)胞結(jié)合的檢驗對照。
【具體實施方式】
[0059]本發(fā)明提供包含一個或多個多糖部分的化合物,所述多糖部分各自獨立地由式β (I — 4)-[GlcNH-R]n-2, 5-脫水甘露糖表示,其中η是3?500的正整數(shù),并且R是H或?;?。在本發(fā)明的一個更【具體實施方式】中,η是3?100、或6?50的正整數(shù)。在一個實施方式中,所述酰基R是乙?;T诹硪粚嵤┓绞街?,所述化合物中至少30%的酰基
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