0134]-在PBS中制備GlcNAc、HA和改性甲殼素片段2mg/mL溶液，并將200μ L的各溶液轉(zhuǎn)移至一組滴度管(titer tube)中。
[0135]-制造在PBS中的兩倍稀釋系列稀釋物，用于總共11種不同濃度的各抑制劑，范圍2mg/mL?1.95 μ g/mL,以及不抑制的對照(最終抑制劑濃度lmg/mL?976ng/mL)。
[0136]-將來自改性甲殼素-TT/弗氏處理組(10yg/小鼠，第50天放血)的收集樣品在1% BSA/PBST中稀釋至20:000倍。
[0137]-將100μ L的稀釋血清樣品轉(zhuǎn)移至各個滴度管(最終40:000稀釋度)，并與抑制劑一起在室溫溫育30分鐘。
[0138]-將100μ L的各血清樣品/抑制劑轉(zhuǎn)移至經(jīng)改性甲殼素-HSA涂布的微孔板中，并在室溫溫育2小時。
[0139]-將板用PBST洗滌3次，然后與在I% BSA/PBST中以1:2500稀釋的100 μ L抗小鼠IgG ( γ -鏈特異性)-HRP 一起在室溫溫育I小時。
[0140]-將孔用PBST洗滌3次，然后與100μ L的SureBlue Reserve TMB過氧化物酶底物一起在室溫溫育5分鐘。
[0141]-用100μ L IN HCl終止反應，并在微板閱讀儀上讀取450nm的吸光度。
[0142]B.抗體反應性特異性對照
[0143]-測試化合物(絲氨酸-Ο-GlcNAc、卵清蛋白、胎球蛋白、透明質(zhì)酸(HA)、胎牛血清)除了 FBS之外均在PBS中制備為2 μ g/mL溶液，F(xiàn)BS制備為在PBS中的10 %溶液(V: V)。
[0144]-將100μ L的各溶液涂布至96孔檢驗板的孔中。在4°C使測試抗原在板中溫育過夜。
[0145]-將孔用PBST洗滌3次，并用I% BSA/PBS封閉I小時。
[0146]-將孔用PBST洗滌3次，并在4°C貯存直到使用。
[0147]-通過處理組收集改性甲殼素疫苗小鼠血清，并1:20稀釋于PBS中。處理組中如下:
[0148]1.PBS/弗氏
[0149]2.改性甲殼素-TT/弗氏；25 μ g/小鼠
[0150]3.改性甲殼素-TT/弗氏；50 μ g/小鼠[0151 ] 4.改性甲殼素-TT/弗氏；100 μ g/小鼠
[0152]-將收集的血清樣品進一步在1%BSA/PBST中稀釋至最終1:20，000倍。
[0153]- 100 μ L的來自各組的稀釋血清樣品一式三份地轉(zhuǎn)移至檢驗板的孔，并在室溫溫育I小時。
[0154]-將板用PBST洗滌3次，然后與在I% BSA/PBST中以1:2500稀釋的100 μ L抗小鼠IgG ( γ -鏈特異性)-HRP 一起在室溫溫育I小時。
[0155]-將孔用PBST洗滌3次，然后與100μ L的SureBlue Reserve TMB過氧化物酶底物一起在室溫溫育5分鐘。
[0156]-用100 μ L IN HCl 停止反應。
[0157]-在微板閱讀儀上讀取450nm的吸光度。
[0158]-注意的是，對于組4的所有重復，ELISA響應均超出線性范圍。將這些樣品任意分配3.0的值，其接近微板閱讀儀的檢出限。這些值可能是低估值。
[0159]C.甲殼素/殼聚糖吸附和抑制
[0160]-在PBS中制備測試化合物(改性甲殼素-HSA或LMffHA-HSA)的2 μ g/mL溶液。
[0161]-將100μ L的各溶液涂布在96孔檢驗板一半的孔中，并在4°C溫育過夜。
[0162]-將孔用PBST洗滌3次，并用在PBS中的I% BSA封閉I小時。
[0163]-用PBST洗滌孔3次。
[0164]-同時，將收集的改性甲殼素疫苗小鼠血清在1%BSA/PBS中稀釋至終濃度1:5000ο
[0165]-將HA MAb#2 在 1% BSA/PBS 中稀釋至 1:2000。
[0166]-將5mL的稀釋血清樣品或HAMAb與10mg的甲殼素或殼聚糖(都制成不溶性懸浮液)一起在4°C在旋轉(zhuǎn)器上溫育過夜。
[0167]-稀釋的甲殼素疫苗#1血清或HAMAb的級分置于4°C以充當陽性對照，并與甲殼素/殼聚糖提取物混合，以用于抑制試驗。
[0168]-平行地，將甲殼素和殼聚糖與5mL的1%BSA/PBS以相同的方式溫育，以提取可溶性甲殼素/殼聚糖而用于抑制測試。
[0169]-將樣品以4500離心5分鐘，以使不溶性甲殼素和殼聚糖成球團析出。
[0170]-將上清液級分取出至新管，并在1%BSA/PBS中稀釋4倍(對于改性甲殼素疫苗，最終 1:20,000 ;對于 HA MAb，最終 1:8,000)。
[0171]-將未處理的改性甲殼素疫苗血清樣品和未處理的HAMAb在l%BSA/PBS(100yLAb或血清+300 μ L BSA/PBS)中類似地稀釋至相當?shù)慕K濃度。
[0172]-對于抑制測試，將未處理血清或Ab溶液用甲殼素或殼聚糖提取物稀釋4倍至相當?shù)慕K濃度(對于改性甲殼素疫苗，最終1:20,000 ;對于HA MAb，最終1:8,000)。在添加至ELISA板之前，將溶液在室溫預溫育30分鐘。
[0173]-一式三份地將100 μ L的各樣品添加至涂布有改性甲殼素-HSA或LMffHA-HSA的ELISA條帶。
[0174]-使樣品在條帶中在室溫溫育I小時。
[0175]-將條帶用PBST洗滌3次，然后與10yL以1:2500稀釋于在1%BSA/PBST中的抗小鼠IgG ( γ -鏈特異性)-HRP 一起在室溫溫育I小時。
[0176]-將孔用PBST洗滌3次，然后與100μ L的SureBlue Reserve TMB過氧化物酶底物一起在室溫溫育5分鐘。
[0177]-用100 μ L IN HCl 停止反應。
[0178]-HA ELISA樣品顯色非常迅速，因此反應在?I內(nèi)終止。類似地，在改性甲殼素疫苗樣品中的陽性對照顯色迅速，因此反應在2分鐘后停止。
[0179]-在微板閱讀儀上讀取450nm的吸光度。
[0180]實施例6:經(jīng)改性甲殼素-TT疫苗免疫的Balb/C小鼠的血清抗體針對白色念珠菌全細胞的免疫反應性的檢驗
[0181]A.全血清與白色念珠菌細胞的結合
[0182]-從Saboraud右旋糖瓊脂板挑選白色念珠菌的單集落，將其用于接種2mL的YPD生長培養(yǎng)基。使培養(yǎng)物在30°C生長過夜，在250RPM搖晃。
[0183]-將100μ L的5χ106細胞/mL懸浮液添加至胺表面改性的條帶孔微量板的各孔中。使細胞在室溫靜置I小時。
[0184]-將100μ L的在PBS中的2%戊二醛溶液添加至各孔。
[0185]-使細胞在室溫交聯(lián)過夜。
[0186]-吸掉固定劑，并用PBST洗滌孔3次。
[0187]-將孔在室溫用在PBS中的1%BSA封閉I小時。
[0188]-同時，將收集的改性甲殼素疫苗小鼠血清在1%BSA/PBS中稀釋至1:20，000濃度。
[0189]-一式三份地在滴度管中分配100 μ L的2mg/mL改性甲殼素或PBS。
[0190]-對于抑制測試，將10yL的血清添加至含有抑制劑(對于改性甲殼素疫苗血清樣品，最終1:40，000 ;對于抑制劑為lmg/mL)的試管。在添加至ELISA板之前，將溶液在室溫預溫育30分鐘。
[0191]-將100μ L的各樣品添加至經(jīng)白色念珠菌涂布的條帶孔板。使樣品在室溫溫育I小時。
[0192]-將帶用PBST洗滌3次，然后與100μ L以1:2500稀釋于I % BSA/PBST中的抗小鼠IgG ( γ -鏈特異性)-HRP 一起在室溫溫育I小時。
[0193]-將孔用PBST洗滌3次，然后與100μ L的SureBlue Reserve TMB過氧化物酶底物一起在室溫溫育。
[0194]- 2分鐘后用100 μ L IN HCl停止反應。
[0195]-在微板閱讀儀上讀取450nm的吸光度。
[0196]B.親和性純化的改性甲殼素反應性抗體與白色念珠菌的結合
[0197]-將20mg的改性甲殼素和高碘酸鹽氧化的HA溶解在pH7.5的2mL的20mMNaP04中。經(jīng)氧化HA需要在室溫過夜以溶解。
[0198]-將UltraLink酰肼凝膠(4mL的漿料，2mL的沉降樹脂)用5體積的pH7.5的20mM NaPO4洗滌。
[0199]-將溶解的糖添加至經(jīng)洗滌樹脂中，使其在室溫反應24小時。
[0200]-將未結合材料排走，并用以下洗滌樹脂:
[0201]1.20 柱體積的 20mM NaPO4, pH 7.5。
[0202]2.5 柱體積的 1X PBS。
[0203]3.10 柱體積的 IX PBS。
[0204]-將收集的改性甲殼素疫苗小鼠血清(來自PBS對照組和10yg的改性甲殼素-TT免疫組)在1% BSA/PBS中稀釋至起始濃度1:40。
[0205]-將100μ L (200 μ L漿料)的改性甲殼素和經(jīng)氧化HA UltraLink酰肼凝膠在微量旋轉(zhuǎn)柱中用500 μ L的PBS洗滌。
[0206]-將200μ L的各血清和親和性樹脂混合并在室溫溫育I小時。
[0207]-通過在8500RPM離心30秒除去未結合材料。
[0208]-將樹脂用500μ L PBST洗滌3次。
[0209]-將pH2.8的200 yL的0.2M甘氨酸添加至各樹脂，使其相互作用?3分鐘。
[0210]-洗脫的蛋白質(zhì)通過離心直接收集至含有pH8的50 μ L的IM Tris的管中。
[0211]-從Sabouraud右旋糖瓊脂板挑選白色念珠菌的單集落，并用于接種2mL的YPD生長培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物在30°C生長過夜，同時以250RPM搖晃。
[0212]-將100μ L的IxlO7細胞/mL懸浮液添加至胺表面改性的條帶孔微量板的各孔中。使細胞在室溫沉降2小時。
[0213]-將100μ L的在PBS中的2%戊二醛溶液添加至各孔。
[0214]-使細胞在室溫交聯(lián)I小時。
[0215]-仔細地吸掉固定劑，并用PBST洗滌孔3次。
[0216]-將孔在室溫用在PBS中的1%BSA封閉I小時。
[0217]-將抗原親和性純化的抗體用在PBS中的1%BSA稀釋1:1，000。
[0218]-在滴度管中制備2倍稀釋系列稀釋物。
[0219]-將100μ L的抗體稀釋液一式三份地添加至白色念珠菌涂布板。
[0220]-使樣品在室溫溫育I小時。
[0221]-將板用PBST洗滌3次，然后與10yL以1:2500稀釋于1%BSA/PBST中的抗小鼠IgG ( γ -鏈特異性)-HRP 一起在室溫溫育I小時。
[0222]-將孔用PBST洗滌3次，然后與100μ L的SureBlue Reserve TMB過氧化物酶底物一起在室溫溫育5分鐘。
[0223]-用100 μ L IN HCl 停止反應。
[0224]-在微板閱讀儀上讀取450nm的吸光度。
[0225]C.通過流式細胞術進行的疫苗誘導的抗體與白色念珠菌的結合
[0226]念珠菌細胞:使用滅菌環(huán)，將來自冷凍原液的白色念珠菌在SDA板上劃線培養(yǎng)，并在30C溫育。使用接種環(huán)挑選來自SDA板的單集落，將其接種至含有50ml YPD的250_ml燒瓶中，在150rpm搖晃下于30C溫育至少18小時。對于使用念珠菌菌絲體階段的試驗，將細胞在37C在含有血清的YPD中溫育150分鐘和300分鐘，然后0/N溫育，以誘導和促進分化成