1 GOOmL
[0061] 溶解后室溫保存，用時稀釋5倍，通常取160mL配制成800mL即可。
[0062] 1.3. 6. 5 10X 轉膜緩沖液
[0063] 甘氨酸（麗75· 〇7) 151. lg
[0064] Tris(MW121. 14) 30. 3g
[0065] 蒸餾水至 1000mL
[0066] 溶解后室溫保存，用時稀釋10倍，并加入甲醇至20%。通常取80mL母液，加560mL 蒸餾水，最加160mL甲醇，配制成800mL即可。（先加甲醇易產(chǎn)生沉淀）
[0067] 1. 3. 6. 6 10XTBS 緩沖液
[0068] Tris(MW121. 14) 24. 2g
[0069] NaCL 80g
[0070] 蒸餾水至lOOOmL濃鹽酸調pH至7. 6,溶解后室溫保存。
[0071] 1. 3. 6. 7 1XTBST 緩沖液
[0072] 10XTBS 緩沖液 100mL
[0073] 蒸餾水 900mL
[0074] Tween-20 lmL
[0075] 取10XTBS緩沖液100mL，加入蒸餾水800mL，因 Tween-20比較粘稠，應緩慢吸取溶 解后室溫保存。
[0076] 1. 3. 6. 8封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶）
[0077] 1XTBST 緩沖液 95-100mL
[0078] 脫脂奶粉 5g
[0079] 溶解后4°C保存，可于4天內使用。
[0080] 1. 4藥物配置
[0081] 1.4. 1 3,4-二羥基苯甲醛（20mg/kg)的配置：稱取適量，用蒸餾水溶解并定容。
[0082] 1. 4. 2 3,4_二羥基苯甲醛（10mg/kg)的配置：取20mg/kg的溶液適量，用蒸餾水 稀釋2倍即可。
[0083] 2.實驗方法
[0084] 2. 1動物分組及給藥方法
[0085] 將體重在250_300g的雄性（Sprague DawLey，SD)大鼠，SPF級，隨機分組，即假手 術組、模型組、3,4-二羥基苯甲醛高劑量組（或稱為8#高組、8#g組，20mg/kg)、3,4-二羥基 苯甲醛低劑量組（或稱為8#低組、8#d組，10mg/kg)，每只大鼠按lmL/100g體積灌胃給藥， 假手術組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，給藥組分別灌胃給予所給受試物（lmL/100g)， 每天一次，連續(xù)給藥5天，手術當天，于造模前0. 5h給藥。每組動物手術缺血2h，再灌注 24h，進彳丁各指標的檢測。
[0086] 2. 2大鼠 MCA0/R模型的復制
[0087] 2. 2. 1石蠟線栓的制作
[0088] 取直徑為0. 26mm的進口釣魚用尼龍線，長約5cm，分別在其兩端18mm、10mm處用黑 色油性記號筆涂黑。取熔點為56°C固體石蠟一塊，加熱熔化將栓線一端5_長的一段垂直 在熔化的石蠟中迅速浸入并提起，在空氣中冷卻，立即凝固的石蠟可牢固的黏附在尼龍線 一端的表面，尼龍線的另一端作相同的處理，用75%的酒精擦拭后置于1 :2500U的肝素生 理鹽水中備用。
[0089] 2. 2. 2大鼠 MCA0/R模型的復制
[0090] 參照Longa、Kugal等及國內報道的方法，并加以改進，采用線栓法復制大鼠 MCA0/ R模型。復制方法如下：
[0091] 將體重在250_300g的雄性（Sprague DawLey，SD)大鼠，SPF級，用10%水合氯醛 (0. 3mL/100g體重）腹腔注射麻醉，頸部剃毛并進行常規(guī)消毒后頸正中偏右0. 5cm處切口約 1. 5cm，用玻璃分針分離大鼠右側頸總動脈（CCA)和迷走神經(jīng)至分叉處，無需分離頸外動脈 (ECA)和頸內動脈（ICA)。結扎CCA近心端，CCA遠心端用1個動脈夾夾閉，在CCA上用縫合 線打一活結，眼科剪在距分叉lcm處剪一"V"形缺口，將栓線經(jīng)缺口插入。松開CCA上動脈 夾，輕輕向右牽拉CCA近心端上的結扎線，向左側調整進線角度使栓線成功進入ICA，再次 向右調整進線角度大約150角，并輕輕牽拉CCA，使栓線進入大腦，若進栓12mm左右就出現(xiàn) 難以進入的情況，提示可能進入了翼顎動脈（PPA)，此時向后退出線栓一段距離，重新向右 上方調整進線角度即可；若重復多次仍不能正確插入，說明已造成ICA的痙攣，血液復流可 消除其痙攣，此時可先退出線栓，待血流恢復3-5min，再實行線栓插入就有很高的成功率。 線栓插入深度為18-20mm(ECA與ICA分叉處為起點），微遇阻力時停止（此時一般會觀察到 大鼠右側臉抽搐），使尼龍線頭端通過MCA起始處，到達較細的大腦前動脈，此時即完成一 側大腦中動脈阻塞（MCA0)，記錄此時的時間，便于定時實施再灌注。然后縫合皮膚，切口外 留lcm的線栓，MCA0后2h再灌注時緩慢的輕拉尼龍線使其頭端回到頸總動脈內，即可實現(xiàn) 大腦中動脈再灌注。拔回線栓后，大腦中動脈供血區(qū)恢復供血，大腦中動脈可得到前交通動 脈、后交通動脈供血，有利于引起再灌注。在缺血及再灌注期間保持室溫在25°C-30°C。大 鼠清醒后，觀察其神經(jīng)功能缺失癥狀，在再灌注24h時進行神經(jīng)病學評分，評分后處死動物 進行各指標的檢測。
[0092] 2. 3神經(jīng)病學評分
[0093] 各組動物于腦缺血2h再灌注24h時，參照Longa并加以改良的5分法進行評分：
[0094] 0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；
[0095] 1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側前爪；
[0096] 2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側轉圈；
[0097] 3分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并向左側傾倒；
[0098] 4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。
[0099] 2. 4腦組織EB含量的測定
[0100] 伊文思藍（EvanSbLue，EB)標準曲線的制作：在610nm處EB溶液具有最大吸收峰。 配制lmg/mL的EB溶液為最大濃度，等比稀釋配制成濃度為l、l/2、l/4、l/8、l/16(mg/mL) 的EB標準溶液，以甲酰胺溶液作為空白對照組調零，在酶標儀上檢測上述EB標準溶液的0D 值，進行回歸分析求得EB標準曲線。
[0101] 腦組織EB含量的測定：各組隨機選取6只大鼠，于腦缺血15min后，經(jīng)股靜脈注射 2%EB溶液（以4mL/kg體重給予），在腦缺血2h再灌注24h后，各組大鼠用10%水合氯醛 (0. 3mL/100g)麻醉后打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向主動 脈內緩慢注入400mL的肝素生理鹽水溶液，至右心房流出液體變清亮。斷頭取腦，去除嗅球 和腦橋，將大腦分為左右兩個半球，取出腦立即測濕重，然后置l〇5°C，恒溫鼓風干燥箱干燥 24h后，再迅速測干重。將干燥的大腦放入甲酰胺溶液中（lmL/半球），50°C孵育24h。然后 2000r/min離心30min，取上清液待測。于酶標板中取上清液200uL，610nm下測定0D值，通 過EB標準曲線計算相應腦組織EB含量（以ug/g干燥腦組織表示）。
[0102] 2. 5 3, 4-二羥基苯甲醛對大鼠缺血側腦組織N0含量、N0S活性的影響
[0103] 各組隨機選取6只大鼠，于腦缺血2h再灌注24h后各組大鼠用10 %水合氯醛 (0. 3mL/100g)麻醉后打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向主動 脈內緩慢注入400mL的肝素生理鹽水溶液，至右心房流出液體變清亮，整個操作于冰浴下 進行。斷頭取腦，去除嗅球和腦橋，取缺血側腦組織，用濾紙吸干表面水分后稱重，剪成小塊 放入10mL預冷的離心管中，于冰浴下勻漿，每100mg組織加入lmL IX PBS，制成勻漿，然后 置于-20°C過夜。經(jīng)過反復凍融2次處理破壞細胞膜后，于4°C 5000g離心5分鐘取上清， 將上清分裝保存于_80°C，解凍后的樣本應再次離心。各取一支上清，按BCA蛋白測定試劑 盒要求測定各組腦組織勻漿液中蛋白的含量，并按N0測定試劑盒要求檢測腦組織勻漿液 中N0的含量；按ELISA試劑盒要求檢測腦組織勻漿中iNOS、nNOS的活性。
[0104] 2. 6測定相關蛋白的表達
[0105] 2. 7.1蛋白提取
[0106] 大鼠連續(xù)給予相應受試藥物5天，末次給藥后30min后，10%的水合氯醛腹腔注射 麻醉SD大鼠，快速斷頭取腦，冰上分取缺血側大腦皮層，稱重后置于10mL事先預冷的離心 管中，置于冰上用組織研磨棒的將其研磨成漿。按照IP及細胞裂解液使用說明書加入適量 的細胞裂解液（每lmg組織加入8uL的裂解液），用微量移液器輕柔吹打數(shù)下使之混勻，冰 上振蕩30min，移入1. 5mL離心管內，14000rpm/轉4°C離心5min，取上清于另一離心管內待 測。
[0107] 2. 7. 2 BCA法檢測總蛋白的濃度
[0108] 1)取適量5mg/mL標準蛋白，用0. 9% NaCL或PBS稀釋至終濃度為2. 5mg/mL。
[0109] 2)根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B (50:1)配制適量BCA 工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內穩(wěn)定。
[0110] 3)將標準品按等比稀釋的方法配制成2. 5mg/mL、1. 25mg/mL、0. 625mg/mL、 0· 3125mg/m