3,4-二羥基苯甲醛對缺血側(cè)腦組織GFAP表達(dá)的影響
[0168] 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織GFAP的表達(dá)明顯缺失，差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ρ〈0.01);與模型組比較，3,4_二羥基苯甲醛低劑量組（10mg/kg)能明顯 下調(diào)模型大鼠缺血側(cè)腦組織GFAP的缺失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0. 05)。詳見表5,圖11。
[0169] 表5 3,4_二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織GFAP表達(dá)的影響(f
[0171] 注：與假手術(shù)組比>AP〈0. 01 ;與模型組比：*P〈0. 05
[0172] 4.2 3,4-二羥基苯甲醛的神經(jīng)保護(hù)作用
[0173] 4. 2. 1 3,4_二羥基苯甲醛對大鼠神經(jīng)病學(xué)評分的影響
[0174] 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠有明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀，神經(jīng)病學(xué)評 分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?〈〇.〇〇1);與模型組比較3,4-二羥基苯甲醛高劑量組（2〇11^/1^)能 明顯改善MCA0/R模型大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0. 01)。詳見表6、圖 12。
[0175] 表6 3,4_二羥基苯甲醛對大鼠神經(jīng)病學(xué)的影響（籠壬》)
[0177] 注：與假手術(shù)組比：AAAP〈0. 001 ;與模型組比：★★?〈0. 01
[0178] 4. 2. 2 3,4_二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織Caspase-3/_9的影響
[0179] 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織Caspase-3、Caspase-9的 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈〇. 05與P〈0. 01);與模型組比較，3,4-二羥基苯甲醛 低（10mg/kg)劑量組能明顯降低模型大鼠缺血側(cè)腦組織Caspase-3/-9的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（P〈〇. 01)。詳見表7、圖13、圖14。
[0180] 表7 3,4-二羥基苯甲醛對大鼠缺血側(cè)腦組織Caspase表達(dá)的影響
[0182] 注：與假手術(shù)組比：AAP〈0. 01，AP〈0. 05 ;與模型組比：★★?〈0. 01
[0183] 4. 3 3,4-二羥基苯甲醛抗N0毒性發(fā)生的作用
[0184] 4. 3. 1 3,4-二羥基苯甲醛對缺血側(cè)腦組織N0含量及N0S活性的影響
[0185] 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織N0含量、nNOS、iNOS的活性 均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈〇. 〇〇1與P〈〇. 05);與模型組比較，3,4-二羥基苯甲 醛高（20mg/kg)、低（10mg/kg)劑量組均能明顯降低模型大鼠缺血側(cè)腦組織N0(P〈0.05與 P〈〇. 01)的含量、nN0S(P〈0. 01)、iN0S(P〈0. 05)的活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表8,圖 15。
[0186] 表8 3,4-二羥基苯甲醛對吣含量及吣5活性的影響（寵：|:?)
[0188] 注：與假手術(shù)組比 >AAP〈0. 001，AP〈0. 05 ;與模型組比：**P〈0. 01，*P〈0. 05
[0189] 5、結(jié)論
[0190] 5. 1 3,4-二羥基苯甲醛對血腦屏障的保護(hù)作用
[0191] 血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB)開放程度的評價(jià)常用EB滲透法，EB是一 種偶氮基熒光染料，入血后幾乎全部與血漿白蛋白結(jié)合，正常情況下不能透過BBB進(jìn)入腦 組織，只有當(dāng)BBB被破壞，通透性升高時，這種復(fù)合物才可透過BBB，BBB通透性升高的程度 越大，則EB透過的量越多，腦組織的染藍(lán)程度越重；進(jìn)入腦組織中的EB可溶于甲酰胺等有 機(jī)溶劑，通過分光光度法可以精確地測量出提取液中的EB含量，進(jìn)而可定量的評價(jià)BBB的 通透性。目前研究表明，引起B(yǎng)BB損傷，通透性增加的機(jī)制主要有：血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密 連接開放，主要結(jié)構(gòu)蛋白（〇ccludin、Claudin-5)降解；水通道蛋白4(AQP-4)過度表達(dá)；基 質(zhì)金屬蛋白蛋白酶（MMPs)表達(dá)升高；其他因素：星型膠質(zhì)細(xì)胞特征蛋白（GFAP)降解等。
[0192] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明3,4_二羥基苯甲醛能降低MCA0/R模型大鼠缺血側(cè)腦組織 EB含量，降低血腦屏障的通透性；能明顯下調(diào)模型大鼠缺血側(cè)腦組織AQP-4的高表達(dá)，減少 TJ相關(guān)蛋白（0ccludin、Claudin-5)的缺失，下調(diào)MMP-3的高表達(dá)，減少GFAP的缺失，表明 3,4_二羥基苯甲醛通過對血腦屏障的保護(hù)作用，從而達(dá)到抗大鼠腦缺血/再灌注損傷的作 用。
[0193] 5.2 3,4-二羥基苯甲醛的神經(jīng)保護(hù)作用
[0194] 腦缺血/再灌注損傷發(fā)生過程中，神經(jīng)保護(hù)的目的在于干預(yù)缺血中心區(qū)外周神經(jīng) 細(xì)胞尚處于"半功能"狀態(tài)的缺血半暗帶（ischemic penumbra)的病理生化級聯(lián)反應(yīng)，防止 或延遲細(xì)胞死亡，避免其發(fā)展為不可逆的梗死。腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡主要 有兩條通路介導(dǎo)，一條是內(nèi)源性途徑，即線粒體凋亡通路；另一條是外源性途徑，即死亡受 體通路。無論是哪條途徑，它們最終均是通過激活細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)器（Caspase家族） 執(zhí)行細(xì)胞凋亡，Caspase家族是一類凋亡調(diào)控蛋白，是細(xì)胞凋亡的啟動者與執(zhí)行者，在凋亡 過程中起關(guān)鍵作用。正常情況下，活細(xì)胞中的Caspase以無活性的酶原形式存在，當(dāng)受到凋 亡誘導(dǎo)信號刺激后而活化，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-9是線粒體/ CytC介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑上的關(guān)鍵酶，Caspase-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是Caspase 級聯(lián)反應(yīng)的最終執(zhí)行者，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。
[0195] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明3,4_二羥基苯甲醛能改善MCA0/R模型大鼠神經(jīng)功能的缺失 癥狀，下調(diào)Caspase-3和Caspase-9的高表達(dá)，表明3,4-二羥基苯甲醛通過抗細(xì)胞凋亡，有 神經(jīng)保護(hù)作用，從而達(dá)到抗大鼠腦缺血/再灌注損傷的作用。
[0196] 5. 3 3,4-二羥基苯甲醛抗N0毒性發(fā)生的作用
[0197] N0是生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì) 胞、神經(jīng)細(xì)胞等合成并釋放，具有神經(jīng)介質(zhì)和調(diào)質(zhì)的功能，廣泛參與體內(nèi)生理和病理活動； 在腦缺血性損傷過程中，N0可能發(fā)揮保護(hù)或損傷的雙重作用，N0S作為介導(dǎo)N0合成的關(guān)鍵 限速酶，可分為神經(jīng)元型（nNOS)、誘生型（iNOS)和內(nèi)皮型（eNOS)，內(nèi)皮細(xì)胞中的N0S主要 為eNOS，通過它產(chǎn)生的N0可擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量從而起到保護(hù)作用，然而，N0的擴(kuò)血 管效應(yīng)時間非常短暫，超過2h則不具神經(jīng)保護(hù)作用；而神經(jīng)細(xì)胞中N0S主要為nNOS，通過 它產(chǎn)生的N0則可產(chǎn)生神經(jīng)毒作用；通過外界刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的iNOS，主要分布于星形膠質(zhì)細(xì) 胞和小膠質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨刺激持續(xù)時間延長，N0產(chǎn)生量增加， 其產(chǎn)生的NO可加重缺血性腦損傷。
[0198] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明3,4_二羥基苯甲醛能明顯降低MCA0/R大鼠缺血側(cè)腦組織的 N0含量、以及抑制iNOS和nNOS的活性，表明3,4_二羥基苯甲醛可以通過抑制腦組織N0的 含量以及調(diào)控N0S通路，抵抗N0的毒性發(fā)生，從而達(dá)到抗大鼠腦缺血/再灌注損傷的作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 3,4-二羥基苯甲醛用于制備治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的藥物的用途。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征是：所述的藥物是治療或/和預(yù)防神經(jīng)功能損傷、 血腦屏障損傷或一氧化氮（NO)毒性反應(yīng)中一種或幾種疾病的藥物。3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征是：所述的藥物是下調(diào)腦組織Caspase-3、 Caspase-9、AQP-4或MMP-3中一種或幾種蛋白表達(dá)的藥物；所述的藥物是升高腦組織 Occludin、Claudin-5或GFAP中一種或幾種蛋白表達(dá)的藥物；所述的藥物是降低腦組織 中NO含量的藥物；所述的藥物是抑制神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)中一種或兩種酶活性的藥物。4. 如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的用途，其特征是：所述的藥物是由有效量的3,4-二 羥基苯甲醛為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征是：所述的制劑為口服制劑。6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征是：所述的制劑為膠囊劑、顆粒劑或片劑。7. -種治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的藥物組合物，其特征是：它是以3,4-二羥 基苯甲醛為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是：所述制劑為口服制劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征是：所述口服制劑為膠囊劑、顆粒劑或片 劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了3，4-二羥基苯甲醛用于制備治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的藥物的用途。藥效實(shí)驗(yàn)表明，該化合物具有顯著的保護(hù)血腦屏障、保護(hù)神經(jīng)功能及抑制NO毒性反應(yīng)發(fā)生的作用，從而達(dá)到治療或/和預(yù)防腦缺血再灌注損傷的效果。相較于目前臨床上常用的同類藥物和治療手段，3，4-二羥基苯甲醛來源廣泛、價(jià)格低廉、療效顯著，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K31/11, A61P9/10
【公開號】CN105232499
【申請?zhí)枴緾N201510695078
【發(fā)明人】林青, 何芳雁, 代蓉, 李秀芳
【申請人】云南中醫(yī)學(xué)院
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月23日