一種快速修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]
在牙本質(zhì)粘接過程中，混合層基底裸露膠原不能被粘結(jié)劑完全包裹，暴露膠原遭內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶降解是縮短樹脂一牙本質(zhì)粘接復(fù)合體耐久性的關(guān)鍵因素。中度及深度齲齒病變也主要表現(xiàn)為牙本質(zhì)層的脫礦。解決這些問題都涉及到對脫礦的牙本質(zhì)進(jìn)行再礦化。隨著研究的深入，牙本質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)、成礦位點(diǎn)與膠原纖維之間的聯(lián)系，非膠原蛋白在牙本質(zhì)生物礦化中的作用以及生物礦化過程逐漸被科學(xué)家揭示，并在體外仿生模擬，脫礦牙本質(zhì)的修復(fù)領(lǐng)域進(jìn)入了仿生再礦化的時(shí)代。目前主流的仿生再礦化方式為:用兩種牙本質(zhì)非膠原蛋白的仿生類似物，在以Portland Cement作為I丐離子緩釋源的含磷溶液中成功地使酸蝕脫礦的牙本質(zhì)再礦化，并且生成纖維內(nèi)礦物和纖維外礦物。但是，這樣的方法耗時(shí)達(dá)四個(gè)月之久，不具備臨床實(shí)用性。而且，該裝置由緩釋鈣離子源，磷離子源，非膠原蛋白類似物等組成，太過復(fù)雜，難以讓臨床醫(yī)生從繁忙的工作中解脫。
[0003]近年對于納米級無定形磷酸鈣顆粒作為存在于生物礦化過程中的前驅(qū)體的研究越來越深入，有學(xué)者研究表明該顆粒內(nèi)部高達(dá)10-20%的含水量和內(nèi)部原子介于晶體和溶液的無序排列賦予了其類似液體的“流動性”，無定形顆粒憑借“流動性”預(yù)先復(fù)制模板的形貌和結(jié)構(gòu)，然后逐漸失水、結(jié)晶、固化生成熱力學(xué)更穩(wěn)定的結(jié)晶態(tài)礦物。無定形磷酸鈣的基本構(gòu)成單元是Ca9(P04)6(Posner Cluster)，這種物質(zhì)被稱作“小團(tuán)簇”，尺寸大約為0.95nm，可以相互團(tuán)聚為尺寸更大的礦物顆粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法。
[0005]本發(fā)明的主要構(gòu)思是調(diào)控谷氨酸的濃度從而控制Posner Cluster的相變時(shí)間，間接調(diào)節(jié)了牙本質(zhì)生物再礦化的速度，按照該方法可以大大縮短脫礦牙本質(zhì)再礦化需要的時(shí)間。
[0006]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是:
本發(fā)明首先合成無定形磷酸鈣顆粒，利用礦化促進(jìn)劑加速脫礦牙本質(zhì)的再礦化。
[0007]所述的合成無定形磷酸鈣顆粒具體是:
用8?10 g/L聚丙烯酸作為無定形磷酸鈣的穩(wěn)定劑，400 mM谷氨酸溶液作為再礦化促進(jìn)劑。在36?38°C下，使用0.1?0.2 M、PH為9.5±0.1的磷酸氫二鈉水溶液和0.2?0.3 Μ氯化鈣水溶液配成母液；采用50 ml注射器在30?40分鐘內(nèi)將氯化鈣水溶液按體積比1:1加入至磷酸氫二鈉水溶液中，反應(yīng)過程中采用磁力攪拌器攪拌，并使用0.1 Μ氫氧化鈉溶液調(diào)控pH保持在9.5±0.5區(qū)間；使得鈣離子最終濃度為9.0?11.0 mM，磷離子的最終濃度為5.0?7.0 mM，谷氨酸的最終濃度為10?100 Mm。聚丙烯酸的最終濃度為300?1000 Pg/mL ;最終合成直徑為15?20 nm的無定形磷酸I丐顆粒，該顆粒合成后以溶液形式貯存；
所述的再礦化脫礦牙本質(zhì)具體是:
步驟1.收集無齲的離體牙，采用渦輪機(jī)將牙釉質(zhì)磨除并在體式顯微鏡下檢查；慢速ISOMET鉆石切片機(jī)垂直于牙長軸，取厚度為0.45?1_的牙本質(zhì)片；
步驟2.將上述牙片放入質(zhì)量濃度為30?35%的磷酸中，酸蝕過程中磷酸用磁力攪拌子攪拌，10秒后取出，用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2?5微米范圍內(nèi)的脫礦牙本質(zhì)層；
步驟3.取20?50 ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于樣品瓶中，將脫礦牙本質(zhì)置于含有無定形磷酸鈣顆粒溶液中，將培養(yǎng)瓶密封；
步驟4.將上述樣品瓶放在35?38 °(:恒溫箱中，于2天后取出。
[0008]本發(fā)明的有益效果:具有良好的生物相容性；符合脫礦牙本質(zhì)修復(fù)中提出的“最大限度保存牙體組織”原則，能以已有脫礦纖維為模板進(jìn)行再礦化；相比于傳統(tǒng)礦化法，本方法由底部至上進(jìn)行礦物生長，并且能夠在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)脫礦牙本質(zhì)的礦物含量，保護(hù)膠原不被基質(zhì)金屬蛋白酶腐蝕，防止脫礦進(jìn)一步發(fā)生，有利于維持良好的樹脂一牙本質(zhì)粘接復(fù)合體耐久性；恢復(fù)了牙本質(zhì)特殊的等級結(jié)構(gòu)；恢復(fù)牙本質(zhì)的力學(xué)性能；相比于已有的仿生礦化法，原料易得，體系簡單；更重要的是，本方法中礦化完成所需要的時(shí)間大大縮短，僅為2天，對于再礦化脫礦牙本質(zhì)技術(shù)來講是一種突破。
【附圖說明】
[0009]圖la為實(shí)施例1，2，3，4中脫礦牙本質(zhì)膠原的掃描電鏡(SEM)圖片。
[0010]圖lb為實(shí)施例1，2，3，4中脫礦牙本質(zhì)膠原的透射電鏡(TEM)圖片。
[0011]圖2a為實(shí)施例1中濃度為50 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控下的不同無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的掃描電鏡(SEM)圖片；圖2b為實(shí)施例2中濃度為200 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控下的不同無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的掃描電鏡(SEM);圖2c為實(shí)施例1中濃度為50ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控下的不同無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的透射電鏡(TEM);圖2d為實(shí)施例1中濃度為200 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控下的不同無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的透射電鏡(TEM)。
[0012]圖3a為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸調(diào)控合成的無定形磷酸I丐顆粒在兩天時(shí)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)中膠原纖維的顯微圖片；圖3b為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在四天時(shí)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)中膠原纖維的顯微圖片；圖3c為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在四天時(shí)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)的縱截面圖片；圖3d為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mM Glu協(xié)同調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在兩天時(shí)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)中膠原纖維的顯微圖片；圖3e為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸與10 mM Glu協(xié)同調(diào)控合成的無定形磷酸|丐顆粒在四天時(shí)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)中膠原纖維的顯微圖片；圖3f為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mM Glu協(xié)同調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在四天時(shí)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)的縱截面圖片。
[0013]圖4a為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸調(diào)控合成的無定形磷酸I丐顆粒在不同時(shí)間段的紅外(FTIR)圖片；圖4b為實(shí)施例4中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mM Glu協(xié)同調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時(shí)間段的紅外(FTIR)圖片；圖4c為實(shí)施例3中350ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在2天時(shí)的透射電鏡(TEM)圖片；圖4d為實(shí)施例4中350 ug/mL的聚丙稀酸與10 mM Glu協(xié)同調(diào)控合成的無定形磷酸I丐顆粒在2天時(shí)的透射電鏡(TEM)圖片；圖4e為實(shí)施例3、4中劈裂峰值(splitting funct1n，SF)計(jì)算示意圖；圖4f中的靠右折線為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時(shí)間的SF圖譜，圖4f中的靠左折線為實(shí)施例4中350 ug/mL的聚丙烯酸與10mM Glu協(xié)同調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時(shí)間的SF圖譜。
[0014]圖5a中下曲線為實(shí)施例1中50 ug/mL的聚丙稀酸調(diào)控下的不同無定形磷酸I丐顆粒在兩天時(shí)的紅外(FTIR)圖譜，圖5a中上曲線為實(shí)施例2中200 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控下的不同無定形磷酸I丐顆粒在兩天時(shí)的紅外(FTIR)圖譜；圖5b為實(shí)施例1中50 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控下的無定形磷酸鈣顆粒在兩天時(shí)的透射電鏡(TEM)圖片；圖5c為實(shí)施例2中200 ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控下的無定形磷酸鈣顆粒在兩天時(shí)的透射電鏡(TEM)圖片。
[0015]圖6為實(shí)施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸調(diào)控合成的無定形磷酸I丐顆粒在不同的時(shí)間內(nèi)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)的納米壓痕強(qiáng)度和實(shí)施例4中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mMGlu協(xié)同調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時(shí)間內(nèi)修復(fù)的脫礦牙本質(zhì)的納米壓痕強(qiáng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述:
實(shí)施例1:
配備0.25M氯化鈣(CaC12)水溶液，0.15M磷酸氫二鈉(Na2HP04)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實(shí)驗(yàn)的母液。取2.4 mL Na2HP04母液和3.30mL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用1M NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9.5±0.1，常溫?cái)嚢?.5 h，總體積為30 mL。取2.4 mL CaC12母液加水稀釋至30 mL。用滴定管將30 mL鈣液30加入30 mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調(diào)控pH保持在9.5±0.5區(qū)間。最終，鈣離子濃度為10.0 mM，磷離子濃度為6.0 mM，PAA濃度為50 ug/mL。保證整個(gè)滴加過程持續(xù)25?30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機(jī)垂直于牙長軸先切除牙釉質(zhì)，再切取厚度為0.5?1 mm的牙本質(zhì)片；然后用500 # -2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質(zhì)量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2?3微米范圍內(nèi)的脫礦牙本質(zhì)模型；取15 ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質(zhì)模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養(yǎng)瓶放在37.5°C恒溫箱中，分別于2、4天后取出。將再礦化的牙本質(zhì)樣本一分為二，一半用酒精梯度脫水的方式進(jìn)行干燥，做掃描電鏡(S