內皮功能障礙和炎癥的疾病的治療的制作方法
【專利說明】
[0001] 優(yōu)先權細節(jié)
[0002] 本申請要求于2012年12月12日提交的名稱為"內皮功能障礙和炎癥的疾病的治 療"的美國臨時專利申請?zhí)?1/736, 361的優(yōu)先權，其全部內容在此通過引用并入。
技術領域
[0003] 本公開設及用于治療或預防內皮功能障礙或炎癥的疾病及其相關病癥的方法。 技術背景
[0004]內皮功能障礙的特征為內皮作用向著降低血管舒張、促炎性狀態(tài)和促凝血特性 變化。血管生物學家通常認為具有導致功能障礙的內皮損傷是動脈粥樣硬化中的啟動事 件（Ross化化re 362:801 - 9, 1993)并且在冠屯、病缺血性臨床表現(xiàn)中起重要作用。內皮 功能障礙還先于動脈粥樣硬化的實際存在巧eddy et al., J Am Coll Cardiol 23:833 -843, 1994)。它還與大多形式的屯、血管?。ㄈ绺哐獕?、冠狀動脈疾病、慢性屯、力衰竭和外周動 脈疾?。?、糖尿病并發(fā)癥（如腎?。┖吐阅I衰竭相關。
[0005] 在內皮功能障礙中參與降低的血管舒張反應的機制包括降低的一氧化氮形 成、氧化過度W及減少超極化因子產生。粘附分子的上調、趨化因子如巨隧細胞趨化膚 (chemoattractant peptide)-1的形成、W及纖溶酶原激活物抑制劑-1的產生參與了炎癥 反應并有助于促凝血狀態(tài)。血管活性膚如血管緊張素II和內皮素-1 ;不對稱二甲基精氨酸 (內源性一氧化氮抑制劑）的累積；高膽固醇血癥；高同型半脫氨酸血癥；改變的膜島素信 號；W及高血糖癥可促進運些不同的機制。例如，在與內皮功能障礙相關的病癥中觀測到血 管緊張素II過量。血管緊張素II被認為是血管緊張素I的競爭性抑制劑，與血管緊張素I 一起參與抑制內皮增厚，促進內皮存活，使支持血管周圍的細胞穩(wěn)定W及抑制內皮通透性。 過量水平的血管緊張素II抑制運些有益效果。
[0006] 內皮功能障礙還是動脈粥樣硬化發(fā)病的重要早期事件，促進血小板啟動和進展。
[0007] 內皮功能障礙還是炎性疾病如敗血癥效果的主要促成者。敗血癥的發(fā)病是復雜網 絡事件的結果。革蘭氏陰性細菌細胞壁的組分（內毒素）是造成敗血癥發(fā)生的主要（雖 然不是唯一的）種類。除了其他細菌分子之外，內毒素引發(fā)設及促炎性介質和抗炎性介質 產生的細胞和體液途徑的普遍反應。運些介質包括細胞因子、凝血因子、粘附分子、屯、肌抑 制物和和熱休克蛋白。內皮是敗血癥-誘導的事件的主要祀標，并且內皮細胞受損和功能 障礙在敗血性休克的病理學中占很大比例。血管內皮細胞是機體與循環(huán)的細菌分子首先相 接觸的細胞。內皮細胞具有識別細菌病原體的結構模式并且隨后啟動炎性介質的表達的機 制。
[0008] 用于治療內皮功能障礙的方法是處理疾病過程中引起內皮功能障礙的組分。例 如，通過補充葉酸降低高同型半脫氨酸血癥中的同型半脫氨酸水平可改善內皮功能障礙。 心精氨酸和四氨生物嚷嶺W及四氨生物嚷嶺模擬物可通過增強一氧化氮的生物利用度而 改善內皮功能。然而，一些研究并未發(fā)現(xiàn)給予k精氨酸能改善內皮功能障礙。
[0009] 已證實他汀類藥物對內皮功能障礙具有有益效果，運可能部分是脂質降低的結 果，也是其多效抗炎效應的結果。然而，他汀類藥物與肌肉疼痛和橫紋肌溶解（其可導致腎 衰竭和死亡）、肌無力、神經病變和健忘相關。此外，他汀類藥物具有相對短的半衰期并且需 要定期給藥W提供療效。例如，阿托伐他汀具有約20-30小時的有效半衰期并且被認為是 長效的他汀類藥物。
[0010] 還表明過氧化物酶體增殖物激活受體丫激動劑改善內皮功能障礙。然而，應當針 對與運類化合物相關的安全考慮而小屯、評估運些化合物的潛在益處，所述安全考慮設及對 液體滯留和充血性屯、力衰竭W及可能增加屯、血管風險。
[0011] 通過前述清楚地可知，本領域對治療或預防內皮功能障礙或炎癥的疾病存在需 要。
[001引簡述
[0013] 在得到本發(fā)明中，本發(fā)明人表明，全身（如通過靜脈）給予患有內皮功能障礙的動 物表達STRO-I的間充質祖細胞或其后代增加了冠狀動脈對內皮特異性擴張劑（緩激膚和 卡己膽堿）的反應，但沒有增加對平滑肌擴張劑硝普鋼的反應。例如，相比沒有用MPC或其 后代治療的動物中的結果，MPC或其后代增加對內皮特異性擴張劑的最大反應，其指示降低 的內皮功能障礙。運些數(shù)據表明表達STRO-I的MPC或其后代或由它們分泌的一種或多種 因子治療或預防內皮功能障礙的發(fā)展。
[0014] 基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本公開提供了用于治療或預防個體的血管內皮功能障礙或 炎癥的疾病的方法，所述方法包括全身給予個體富集STRO-r細胞的細胞群和/或其后代 和/或源自它們的可溶性因子。.
[0015] 在一實例中，所述個體患有由內皮功能障礙引起的病癥。
[0016] 在一實例中，所述內皮功能障礙位于血管內，例如為血管內皮功能障礙。
[0017] 在一實例中，由內皮功能障礙引起的病癥選自：敗血癥、高血壓、冠狀動脈疾病、慢 性屯、力衰竭和外周動脈疾病、腎病及慢性腎衰竭。
[001引在一實例中，由內皮功能障礙引起的病癥為腎病。因而，在一實例中，本公開提供 了用于治療或預防個體腎病的方法，所述方法包括全身給予個體富集STRO-r細胞的細胞 群和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0019] 在一實例中，所述腎病為糖尿病腎病。因而，在一實例中，本公開提供了用于治療 或預防個體糖尿病腎病的方法，所述方法包括全身給予個體富集STRO-r細胞的細胞群和/ 或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0020] 在另一實例中，所述病癥為動脈粥樣硬化。因而，在一實例中，本公開提供了用于 治療或預防個體動脈粥樣硬化的方法，所述方法包括全身給予個體富集STRO-r細胞的細 胞群和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0021] 在一實例中，所述疾病為炎癥疾病。炎癥疾病可W為全身炎癥反應綜合征，如敗血 癥、敗血性休克或敗血癥樣病癥。在另一實例中，所述病癥為敗血癥或敗血性休克。因而， 在一實例中，本公開提供了用于治療或預防個體敗血癥或敗血性休克的方法，所述方法包 括全身給予個體富集STRO-r細胞的細胞群和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。
[0022] 敗血癥、敗血性休克或敗血癥樣病癥可由病毒、真菌、原生動物或細菌引起。
[0023] 在一實例中，所述方法包括給予富集STRO-I胃細胞的細胞群和/或其后代和/或 源自它們的可溶性因子。
[0024] 在一實例中，所述富集STRO-r細胞的細胞群和/或其后代和/或源自它們的可 溶性因子通過靜脈給予。在運方面，本發(fā)明人已表明，全身給予STRO-r細胞和/或其后 代能夠改善內皮功能障礙。因而，本公開考慮在個體遠離內皮功能障礙部位的位置處給予 STRO-r細胞和/或其后代。
[002引在一實例中，W足W減少個體IL-6、TNFa和/或IL-17的量給予STRO-r細胞和 /或其后代和/或源自它們的可溶性因子。通過減少運些炎性細胞因子的水平，本公開的方 法預防了內皮功能障礙。
[0026] 在一實例中，W足W增加個體（如個體內皮中）血管生成素I水平的量給予 STRO-r細胞和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子。如上所述，血管生成素II (血管生 成素I的括抗劑）的水平在患有內皮功能障礙的個體中提高。本發(fā)明人已表明，STRO-rMPC 和/或其后代分泌血管生成素II，推斷運將有助于治療內皮功能障礙。
[0027] 在一實例中，W足W增強個體內皮（如，血管內皮）擴張（如，在應答諸如緩激膚 或卡己膽堿的內皮擴張劑時）的量給予STRO-r細胞和/或其后代和/或源自它們的可溶 性因子。
[0028] 在一實例中，STRO-r細胞和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子W足W增強 個體內皮（如，血管內皮）擴張而不增強平滑?。ㄈ纾芷交。U張（如，在應答諸如 硝普鋼的平滑肌擴張劑時）的量給予。
[0029] 細胞的示例性劑量包括每千克0. 1 X IO6至5 X 10 6STRO-I+細胞和/或其后代。例 如，所述方法包括每千克給予0. 3 X IO6至2 X 10 6STRO-I+細胞和/或其后代。
[0030] 在一實例中，將細胞W約0. 3 X IO6細胞Ag至約4 X 10 6細胞Ag的劑量給予，如 約0. 3 X IO6細胞Ag至約2 X 10 6細胞/kg。
[0031] 本方法的一種方式設及給予低劑量STRO-r細胞和/或其后代。運種低劑量為， 例如 0. 1 X 1〇5至約 0. 5 X 10 6STRO-I+細胞 Ag,如約 0. 3 X 10 6STRO-I+細胞 /kg。
[0032] 在另一實例中，將高劑量的細胞給予個體。示例性劑量包括至少約1. 5 X IO6細胞 Ag。例如，高劑量包括約1. 5X IO6至約4X 10 6細胞/kg。例如，高劑量包括約1. 5X 10 6或 約2X IO6細胞/kg。
[0033] 在一實例中，隊直定的身體劑量化Ody dose)給予細胞，即不考慮個體體重。
[0034] 在一實例中，不考慮個體體重，W約10000萬至30000萬細胞的劑量給予細胞。
[0035] 在一實例中，不考慮個體體重，W約10000萬至20000萬細胞的劑量給予細胞。
[0036] 在一實例中，不考慮個體體重，W約10000萬細胞的劑量給予細胞。
[0037] 在一實例中，不考慮個體體重，W約15000萬細胞的劑量給予細胞。
[0038] 在一實例中，不考慮患者體重，W約20000萬細胞的劑量給予細胞。
[0039] 在一實例中，不考慮患者體重，W約30000萬細胞的劑量給予細胞。
[0040] 在一實例中，將STRO-r細胞和/或其后代和/或源自它們的可溶性因子與多硫 酸化聚糖相組合給予。
[0041] 在另一實例中，所述多硫酸化聚糖為戊聚糖多硫酸醋（PP巧或其藥學可接受的 鹽，例如，所述PPS為PPS的鋼鹽（NaPP巧或PPS的巧鹽（CaPPS)。例如，PPS的鹽為NaPPS。
[0042] 在一實例中，所述PPS的濃度依賴于組合物中STRO-r細胞和/或其后代和/或 源自它們的可溶性因子的數(shù)目。
[004引在一實例中，所述PPS的濃度為約5ng/ml/百萬細胞至lOmg/ml/百萬細胞或 500ng/ml/百萬細胞至lOmg/ml/百萬細胞，500ng/ml/百萬細胞至2000 y g/ml/百萬細胞， 1 y g/ml/百萬細胞至1000 Ji g/ml/百萬細胞，或1 Ji g/ml/百萬細胞至500 Ji g/ml/百萬細 胞，500ng至10 y g/ml/百萬細胞，1 y g至10 y g/ml/百萬細胞，1 y g至8 y g/ml/百萬細 胞，1 y g至6 Ji g/ml/百萬細胞，1 Ji g至5 Ji g/ml/百萬細胞，1 Ji g至3 Ji g/ml/百萬細胞， 2 y邑至6 y邑/ml/百萬細胞，2. 5 y邑至5 y邑/ml/百萬細胞，或3 y邑至5 y邑/ml/百萬細胞， 1 Ji g至100 Ji g/ml/百萬細胞，1 Ji g至50 Ji g/ml/百萬細胞，1 Ji g至20 Ji g/ml/百萬細胞， 1 y g至15 y g/ml/百萬細胞，10 y g至100 y g/ml/百萬細胞，20 y g至100 y g/ml/百萬細 胞，或 50 Ji g 至 100 Ji g/ml/ 百萬細胞，1 Ji g 至 1000 Ji g/ml/ 百萬細胞，100 Ji g 至 800 Ji g/ ml/百萬細胞，100 y g至600 y g/ml/百萬細胞，100 y g至500 y g/ml/百萬細胞，200 y g至 500 Ji g/ml/百萬細胞。
[0044] 在一實例中，PPS的量為約Img至lOOmg/7500萬細胞，例如約25-75mg/7500萬細 胞，如，約75mg/7500萬細胞（如，Img/百萬細胞）。
[0045]在進一步的實例中，PPS 的濃度為約 500ng，liig，2iig，2.5iig，5iig，10yg， 15 Ji g，20 Ji g，30 Ji g，40 Ji g，50 Ji g，60 Ji g，70 Ji g，80 Ji g，90 Ji g，100 Ji g，150 Ji 邑，200 Ji g， 250 y 邑，300 y 邑，350 y 邑，400 y 邑，450 y 邑，500 y 邑，550 y 邑，GOO y 邑，G50 y 邑，了00 y 邑，了50 y 邑， 800 Ji g,850 Ji g,900 Ji g,950 y g, 1000 y g, 1050 y g, 1100 y g, 1150 y g, 1200 y g, 1250 y g, 1300 y g，1350 y g，1400 y g，1450 y g，1500 y g，1550 y g，1600 y g，1650 y g，1700 y g， 1750 y g，1800 y g，1850 y g，1900 y g，1950 y g，或 2000 y g/ml/ 百萬細胞。
[004引例如，給予的PPS總量為約I至lOOmg。
[0047] 例如，給予的PPS總量為約75mg。
[0048] 在另一實例中，可W諸如W在每毫升待給予個體的組合物中產生0.0 l至100微克 PPS的濃度的量給予PPS，例如，每毫升組合物0. 1至50微克，每毫升組合物0. 1至50微克， 每毫升組合物0. 1至10微克，每毫升組合物1至10微克，每毫升組合物2至8微克，每毫 升組合物4至6微克，或者每毫升組合物4、5或6微克。
[0049] 在一實例中，將富集STRO-r細胞的細胞群和/或其后代和/或源自它們的可溶 性因子與PPS -起或不與PPS -起每周一次或更少給予，如每四周一次或更少。
[0050] 本公開還考慮多次給予細胞和/或可溶性因子。例如，運種方法可包括給予細胞 并監(jiān)測個體W確定何時內皮功能障礙的一種或多種癥狀出現(xiàn)或重現(xiàn)，W及給予進一步劑量 的細胞和/或可溶性因子。評估內皮功能障礙癥狀的合適方法對本領域技術人員是顯而易 見的和/或如本文所述。
[0051] 在另一實例中，將細胞和/或可溶性因子按固定時間表給予，例如，一周或兩周或 =周或四周或五周或六周或更長時間一次。
[0052] 在一實例中，富集STRO-r細胞的細胞群和/或后代細胞為自體或同種異體的，和 /或可溶性因子可源自自體或同種異體細胞。
[0053] 在一實例中，在給予前和/或獲得可溶性因子之前，將富集STRO-r細胞的細胞群 和/或后代細胞經培養(yǎng)擴增。 ^
[0054] 在一實例中，富集STRO-r細胞的細胞群為STRO-I胃和/或表達組織非特異性堿 性憐酸酶燈NAP)，和/或后代細胞和/或可溶性因子源自為STRO-I胃和/或表達TNAP的 STRO-r 細胞。
[0055] 在一實例中，將STRO-r細胞和/或其后代細胞和/或源自它們的可溶性因子W 組合物的形式給予，所述組合物包括所述STRO-r細胞和/或其后代細胞和/或源自它們 的可溶性因子W及載體和/或賦形劑。
[0056] 在一實例中，所述個體為哺乳動物，例如靈長類動物，如人類。在另一實例中，所述 個體為非人的動物（如非人的哺乳動物），如家養(yǎng)哺乳動物，如狗或貓或馬或?；蚓d羊。
[0057] 本公開另外提供了富集STRO-r細胞的細胞群和/或其后代和/或源自它們的可 溶性因子，任選地與PPS相組合，用于治療或預防個體內皮功能障礙或由內皮功能障礙引 起的病癥。
[0058] 本公開另外提供了富集STRO-I+細胞的細胞群和/或其后代和/或源自它們的可 溶性因子，任選地與PPS相組合，在制備用于治療或預防個體內皮功能障礙或由內皮功能 障礙引起的病癥中的應用。
【附圖說明】
[0059] 圖1.由成人骨髓單個核細胞度MMNC)共表達TNAP (STR0-3)和間充質前體細胞標 志物-STRO-I胃。雙色免疫巧光和流式細胞術通過解育STRO-I MACS-選擇的BMMNC來進行， 用與FITC結合的山羊抗-鼠IgM抗體間接標記（X軸），W及用與PE結合的山羊抗-鼠IgG 間接標記的STR0-3mAb (鼠IgGl) (y軸）。點狀直方圖代表W列表型（Iistmode)數(shù)據收集 的5X IO4個事件。將垂直線和水平線設定為反應水平 < 利用在相同條件下處理的同種型 匹配對照抗體-IBS(IgG)和1A6. 12 (IgM)獲得的平均巧光的1.0%。結果證明，STRO-I胃細 胞的較小群共表達TNAP (右上象限），而剩余的STRO-r細胞不能與STR0-3mAb反應。
[0060] 圖2.培養(yǎng)和擴增的STRO-I亮MPC的STRO-I胃或STR0-1?*后代的基因表達譜。離 體擴增的骨髓MPC的單細胞懸液通過膜蛋白酶/EDTA處理來制備。將細胞用STRO-I抗體 染色，隨后通過與山羊-抗鼠IgM-異硫氯酸巧光素解育來顯現(xiàn)。巧光活化細胞分選之后 (A)，由表達STR0-1?*或STRO-I胃的細胞的純化群制備總細胞RNA。利用RNAzoIB提取法 和標準程序，從每個亞細胞群中分離總RNA并用作CDNA合成的模板。使用如前所述的標準 方案（Gronthos et al. J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003)，通過 PCR 擴增來評估不同轉錄 物的表達。在本研究中使用的引物組顯示于表2中。擴增之后，每一反應混合物通過1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳來分析并通過漠化乙錠染色顯現(xiàn)度）。利用ImageQant軟件，參照管家基因 GAPDH的表達來評估各個細胞標志物的相對基因表達（C)。
[0061]圖3.培養(yǎng)和擴增的STRO-rMPC的STRO-I胃后代表達高水平的SDF-I，STR0-1?*后 代則沒有。（A)利用FACS，根據STRO-I胃和STR0-1?*/?區(qū)域，將嫩CS-分離的STRO-rBMMNC 制備物分成不同的STRO-I亞集。從各個STRO-I亞群制備總RNA并用于構建STRO-I胃消減 雜交庫度-C)。復制硝化纖維素濾膜，其已具有從用STRO-I胃消減的CDNA轉化的細菌克隆 擴增的代表性PCR產物的印跡。接著用[ 32門脫氧胞巧S憐酸（dCT巧-標記的STRO-I胃度） 或STR0-1?*/?消減的CDNA(C)來探測濾膜。箭頭指示含有對應于人SDF-I的CDNA片段的 1個克隆的差異表達。值）逆轉錄酶（RT)-PCR分析，其顯示了培養(yǎng)前由新鮮的MCS/