一種rgd標(biāo)記的熒光金納米簇的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于熒光/CT雙模成像并能夠靶向腫瘤細(xì)胞的納米制劑的制備方法，進(jìn)一步涉及這類復(fù)合型多功能納米粒子作為熒光探針及CT成像造影劑在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]為了提高腫瘤的診斷和治療效果，靶向腫瘤成像和藥物傳送成為了重要的醫(yī)療手段。
[0003]CT成像是利用不同的組織或器官由于自身不同的密度與厚度，對(duì)X射線產(chǎn)生不同程度的衰減作用，形成不同組織或器官的灰階影像對(duì)比分布圖，從而以病灶的相對(duì)位置、形狀和大小等的改變來(lái)判斷病情的醫(yī)學(xué)成像方法。CT成像技術(shù)具有空間分辨率高、圖像采集時(shí)間短、可整體成像的優(yōu)點(diǎn)，是一種最為普遍的疾病診斷成像模式。但是，CT成像技術(shù)也存在一些不足之處亟需解決，如對(duì)軟組織分辨率差、檢測(cè)過(guò)程中存在放射性輻射等問(wèn)題。這就需要使用CT造影劑來(lái)提高病灶部位的分辨率，目前臨床上使用的CT造影劑主要是含碘小分子化合物，例如泛影酸和碘海醇等。人體腎臟對(duì)含碘小分子化合物有快速清理效應(yīng)，使得這種造影劑只有很短的成像時(shí)間，并且它對(duì)腎臟還有一定的毒副作用?；诩{米顆粒的CT造影劑能夠解決上述問(wèn)題，它能夠有效地延長(zhǎng)成像時(shí)間，對(duì)于腎臟的毒副作用小，并且造影效果好。
[0004]熒光成像是一種直觀、原位的可視化觀測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)腫瘤以及對(duì)細(xì)胞核藥物進(jìn)行示蹤。和其他成像相比，它更加便宜、更加安全并且能夠在短暫光照下快速成像。這些優(yōu)勢(shì)使其能夠在手術(shù)過(guò)程中便于識(shí)別腫瘤，對(duì)治療過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。但是由于光散射，體內(nèi)黑色素、血紅蛋白和水等對(duì)光的吸收，組織自發(fā)光形成背景干擾，導(dǎo)致利用紫外可見(jiàn)光的熒光成像對(duì)組織的穿透性差，成像信號(hào)的信噪比降低，從而獲取的圖像僅能到達(dá)表皮下幾十微米，而且并不清晰。基于近紅外納米探針的熒光成像技術(shù)能夠獲取更深層更清晰的活體熒光圖像，具有背景干擾低、對(duì)細(xì)胞損傷小、樣品穿透性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，顯示了較好應(yīng)用前景。
[0005]首先，新型金屬納米簇(Au，Ag和Pt等)由幾個(gè)至大約一百個(gè)原子組成，是連接原子和納米粒子的一座橋梁。其中，金納米簇(AuNCs)的粒徑大部分都小于2nm，因?yàn)榧{米簇的尺寸大小接近電子費(fèi)米波長(zhǎng)，使得狀態(tài)的連續(xù)能量強(qiáng)度分解成了離散的能級(jí)，導(dǎo)致了它獨(dú)特的光學(xué)和電化學(xué)特性。這種超小粒徑還賦予了它更多不同于傳統(tǒng)納米粒子和有機(jī)熒光染料的特性，例如強(qiáng)的發(fā)光特性，大的斯托克斯位移，高發(fā)射率和良好的光穩(wěn)定性。不同于有生物毒性的重金屬粒子組成的熒光量子點(diǎn)(QDs)，金納米簇能夠通過(guò)簡(jiǎn)易的水溶性方法制得，可以和不同的生物配體相結(jié)合，從而作為生物相容性熒光基團(tuán)，被廣泛應(yīng)用在生物標(biāo)記等方面。金屬納米簇作為一種具有超小粒徑、低毒性、獨(dú)特光學(xué)和理化性質(zhì)的納米材料，是理想的靶向腫瘤成像熒光納米材料。同時(shí)，目前的CT造影劑大多基于碘(原子數(shù)=53)，它的血液中半衰期很短(〈10 min)，而且原子個(gè)數(shù)也會(huì)影響它的CT造影效果。因?yàn)椴荒芎蜕飿?biāo)記物耦合，碘造影劑對(duì)腫瘤沒(méi)有特異性靶向作用，腎臟的清理作用也使它的成像時(shí)間很短。綜上所述，很有必要開(kāi)發(fā)一種新型的CT造影劑。金納米簇?fù)碛泻艽蟮腦射線吸收系數(shù)，是用來(lái)做CT造影劑的理想選擇。因此，基于金納米簇的腫瘤部位熒光/CT雙模成像，能夠有效地對(duì)早期癌組織和原位腫瘤形態(tài)大小等進(jìn)行檢測(cè)。
[0006]為了能夠更有效地實(shí)現(xiàn)金納米簇的在體腫瘤診斷或治療，選擇一種合適的生物配體使得金納米簇能選擇性的傳遞至腫瘤細(xì)胞是很有必要的。α ν β 3整合素是一種在活化和增殖的內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的特異性標(biāo)記物，常被認(rèn)為是惡性腫瘤的標(biāo)志。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)是一種氨基酸短序列，可以靶向ανβ3整合素受體。環(huán)RGD多肽對(duì)蛋白水解有更好的抗性，而且對(duì)目標(biāo)有更好的親和力。在本發(fā)明中，我們將RGD和AuNCs共價(jià)結(jié)合，然后用RGD標(biāo)記的AuNCs進(jìn)行腫瘤靶向光學(xué)/CT雙模成像。
[0007]目前大部分關(guān)于金納米材料的專利都只涉及了金納米粒子或者金納米簇的制備和應(yīng)用。如，中國(guó)發(fā)明專利“穩(wěn)定金納米簇的形成方法、含有穩(wěn)定金納米簇的組合物和制品”(CN102150034A)公開(kāi)了金納米簇的形成方法及其用于測(cè)定汞離子在樣品中的存在與否和濃度的測(cè)定方法；中國(guó)發(fā)明專利“水溶性金納米團(tuán)簇的制備方法”(CN101406961A)公開(kāi)了一種粒徑為1.5±0.2nm具有高分散性的水溶性金納米團(tuán)簇的制備方法；中國(guó)發(fā)明專利“順磁性金屬配合物功能化的熒光金納米簇磁共振和熒光成像造影劑”(CN102366632A)公開(kāi)了一種順磁性金屬配合物功能化的熒光金納米簇磁共振和熒光成像造影劑；中國(guó)發(fā)明專利“一種熒光探針葉酸功能化的熒光金納米簇的制備方法”(CN103627386A)公開(kāi)了一種利用葉酸作為還原劑合成葉酸功能化的熒光金納米簇的方法。而本發(fā)明制備的RGD標(biāo)記的熒光金納米簇的工藝還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，尤其是用一種以RGD做靶向配體的熒光納米探針的方法未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種RGD靶向腫瘤細(xì)胞的熒光金納米簇(RGD-AuNCs@BSA)的制備方法，該方法制備出的金納米簇具有熒光發(fā)射效率高，生物相容性好，細(xì)胞毒性小以及靶向腫瘤細(xì)胞效率高等優(yōu)點(diǎn)。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種近紅外熒光成像探針的制備方法。
[0010]本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種高分辨率CT成像的CT造影劑的制備方法。
[0011]為達(dá)到以上的目的，本發(fā)明是采取如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的:
[0012]步驟1，金納米簇(AuNCsOBSA)的制備方法:
[0013]步驟1.1，量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %氯金酸溶液1.7mL,加入3.3mL去離子水，得到5mL，10mM氯金酸溶液,劇烈攪拌；
[0014]步驟1.2，稱取250mg BSA，溶解在5mL去離子水中，得到5mL，50mg mL 1 BSA溶液；
[0015]步驟1.3，稱取20mg NaOH,溶解在0.5mL去離子水中，得到1M NaOH水溶液；
[0016]步驟1.4，將BSA溶液加入劇烈攪拌的氯金酸溶液，控溫37°C，持續(xù)攪拌30分鐘；
[0017]步驟1.5，將NaOH水溶液(1M，0.5_5mL)加入上述混合液中；
[0018]步驟1.6，持續(xù)劇烈攪拌上述反應(yīng)物，控溫37°C，持續(xù)時(shí)間12_24h ；
[0019]步驟1.7，將得到的產(chǎn)物冷卻至室溫，裝進(jìn)再生纖維透析袋中，透析外液用水，放置在4 °C冰箱中透析12-48h ；
[0020]步驟1.8，透析后的溶液用lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，得到4mL熒光金納米簇；
[0021 ]步驟 2，RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0022]步驟2.1，取2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4，20mM)中，加入40-60mg EDC，避光條件室溫下反應(yīng)20min ；
[0023]步驟2.2，加入30_50mg的NHS，在黑暗中劇烈攪拌lh ；
[0024]步驟2.3,向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(l-10mL,4mg.mL:),室溫下攪拌反應(yīng)12-24h ；
[0025]步驟2.4，反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過(guò)量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0026]需要說(shuō)明的是，在步驟1.5中所述NaOH溶液的體積為0.5_5mL ;在步驟1.6所述的攪拌持續(xù)時(shí)間12_24h ;在步驟1.7中所述透析時(shí)長(zhǎng)為12-48h ;在步驟2.1中所述的活化AuNCs所用的EDC為40-60mg ;在步驟2.2中所述的活化AuNCs所用的NHS為30_50mg ;在步驟2.3中所述的c(RGDyK)溶液加入量為1-lOmL ;在步驟2.3中所述的活化后AuNCs和RGD反應(yīng)時(shí)間為12-24h ;在步驟2中金納米簇表面的RGD靶向腫瘤血管的α ν β 3受體，對(duì)腫瘤進(jìn)行特異性結(jié)合。
[0027]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，有如下明顯的有益效果:
[0028]本發(fā)明所涉及到的合成方法簡(jiǎn)便易操作，納米粒子具有粒徑小，細(xì)胞毒性低，靶向性好的特性。
[0029]本發(fā)明所合成的納米探針同時(shí)具有穩(wěn)定的熒光特性和良好的CT造影特性。
[0030]本發(fā)明所合成的納米探針在其表面可以復(fù)合多種種類的功能基團(tuán)，為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了多種多功能的復(fù)合納米粒子的制備方法。
[0031]本發(fā)明所合成的納米探針具有重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其是在腫瘤和軟組織成像及治療方面，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0032]以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0033]圖1為制備R⑶標(biāo)記的金納米簇的過(guò)程原理圖。由圖知本發(fā)明所涉及的合成方法簡(jiǎn)單易操作。
[0034]圖2為本發(fā)明實(shí)例5所制得的金納米簇的透射電鏡圖。
[0035]圖3為本發(fā)明實(shí)例5和實(shí)例8所制的金納米簇和RGD修飾金納米簇的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。
[0036]圖4為本發(fā)明實(shí)例5和實(shí)例8所制的金納米簇和RGD修飾金納米簇的熒光發(fā)射圖譜。由圖可知，用RGD標(biāo)記后的金納米簇?zé)晒夤庾V有峰值移動(dòng)。
[0037]圖5為本發(fā)明實(shí)例5和實(shí)例8所制的金納米簇和RGD修飾金納米簇的不同時(shí)間點(diǎn)的Zeta電勢(shì)對(duì)比圖。由圖可知，RGD標(biāo)記的金納米簇Zeta電勢(shì)上升。
【具體實(shí)施方式】
[0038]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0039]實(shí)施例1
[0040]金納米簇(AuNCsOBSA)的制備:
[0041]分別配制氯金酸水溶液(10mM,5mL)和BSA水溶液(50mg.mL 1, 5mL);將氯金酸水溶液加入BSA水溶液中，在37攝氏度下恒溫劇烈攪拌30分鐘；配制NaOH水溶液(1M，0.5mL), 30分鐘后加入氯金酸BSA混合溶液中，在37°C下持續(xù)攪拌12h ;反應(yīng)后的產(chǎn)物在去離子水中透析12h，然后用lOkDa超濾管離心。
[0042]實(shí)施例2
[0043]金納米簇(AuNCsOBSA)的制備:
[0044]分別配制氯金酸水溶液(10mM,5mL)和BSA水溶液(50mg.mL 1, 5mL);將氯金酸水溶液加入BSA水溶液中，在37攝氏度下恒溫劇烈攪拌30分鐘；配制NaOH水溶液(1M，0.5mL), 30分鐘后加入氯金酸BSA混合溶液中，在37°C下持續(xù)攪拌16h ;反應(yīng)后的產(chǎn)物在去離子水中透析12h，然后用lOkDa超濾管離心。
[0045]實(shí)施例3
[0046]金納米簇(AuNCsOBSA)的制備:
[0047]分別配制氯金酸水溶液(10mM,5mL)和BSA水溶液(