50mg.mL 1, 5mL);將氯金酸水溶液加入BSA水溶液中，在37攝氏度下恒溫劇烈攪拌30分鐘；配制NaOH水溶液(1M，0.5mL)，30分鐘后加入氯金酸BSA混合溶液中，在37°C下持續(xù)攪拌24h ;反應(yīng)后的產(chǎn)物在去離子水中透析12h，然后用lOkDa超濾管離心。
[0048]實(shí)施例4
[0049]金納米簇(AuNCsOBSA)的制備:
[0050]分別配制氯金酸水溶液(10mM, 5mL)和BSA水溶液(50mg.mL 1, 5mL);將氯金酸水溶液加入BSA水溶液中，在37攝氏度下恒溫劇烈攪拌30分鐘；配制NaOH水溶液(1M，0.5mL)，30分鐘后加入氯金酸BSA混合溶液中，在37°C下持續(xù)攪拌24h ;反應(yīng)后的產(chǎn)物在去離子水中透析24h，然后用lOkDa超濾管離心。
[0051]實(shí)施例5
[0052]金納米簇(AuNCsOBSA)的制備:
[0053]分別配制氯金酸水溶液(10mM,5mL)和BSA水溶液(50mg.mL 1, 5mL);將氯金酸水溶液加入BSA水溶液中，在37攝氏度下恒溫劇烈攪拌30分鐘；配制NaOH水溶液(1M，0.5mL)，30分鐘后加入氯金酸BSA混合溶液中，在37°C下持續(xù)攪拌24h ;反應(yīng)后的產(chǎn)物在去離子水中透析48h，然后用lOkDa超濾管離心。
[0054]實(shí)施例6
[0055]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0056]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4,20mM)中，加入40mg EDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入30mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(lmL,4mg.mL:)，室溫下攪拌反應(yīng)12h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0057]實(shí)施例7
[0058]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0059]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4,20mM)中，加入50mg EDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入40mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(3mL,4mg.mL:)，室溫下攪拌反應(yīng)12h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0060]實(shí)施例8
[0061]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0062]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4,20mM)中，加入50mg EDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入40mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(5mL,4mg.mL:)，室溫下攪拌反應(yīng)12h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0063]實(shí)施例9
[0064]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0065]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4,20mM)中，加入50mg EDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入40mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(8mL,4mg.mL:)，室溫下攪拌反應(yīng)12h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0066]實(shí)施例10
[0067]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0068]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4，20mM)中，加入50mgEDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入40mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(10mL，4mg.mL》，室溫下攪拌反應(yīng)12h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0069]實(shí)施例11
[0070]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0071]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4,20mM)中，加入50mg EDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入40mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(5mL,4mg.mL:)，室溫下攪拌反應(yīng)24h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0072]實(shí)施例12
[0073]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0074]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4,20mM)中，加入60mg EDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入50mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(5mL,4mg.mL ，室溫下攪拌反應(yīng)12h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mLPBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0075]實(shí)施例13
[0076]RGD-AuNCsiBSA 的制備方法:
[0077]將2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4，20mM)中，加入60mgEDC,避光條件室溫下反應(yīng)20min ;然后加入50mg的NHS,在黑暗中劇烈攪拌lh ;最后向混合液中倒入c(RGDfk)溶液(5mL，4mg.mL》，室溫下攪拌反應(yīng)24h ;反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mL PBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。
[0078]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種RGD標(biāo)記的熒光金納米簇的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟1，金納米簇(AuNCsOBSA)的制備方法: 步驟1.1，量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的氯金酸溶液1.7mL，加入3.3mL去離子水，得到5mL，10mM氯金酸溶液,劇烈攪拌； 步驟1.2，稱取250mg BSA，溶解在5mL去離子水中，得到5mL，50mg mL 1 BSA溶液； 步驟1.3，稱取20mg NaOH，溶解在0.5mL去離子水中，得到1M NaOH水溶液； 步驟1.4，將BSA溶液加入劇烈攪拌的氯金酸溶液，控溫37°C，持續(xù)攪拌30分鐘； 步驟1.5，將NaOH水溶液(1M，0.5_5mL)加入上述混合液中； 步驟1.6，持續(xù)劇烈攪拌上述反應(yīng)物，控溫37°C，持續(xù)時(shí)間12-24h ； 步驟1.7，將得到的產(chǎn)物冷卻至室溫，裝進(jìn)再生纖維透析袋中，透析外液用水，放置在4 °C冰箱中透析12-48h ； 步驟1.8，透析后的溶液用lOkDa的超濾管離心(3000 Xg，20min)，得到4mL熒光金納米簇； 步驟2，RGD-AuNCsiBSA的制備方法: 步驟2.1，取2mL超濾離心后的金納米簇加到8mL PBS緩沖液(PH = 7.4,20mM)中，力口入40-60mg EDC，避光條件室溫下反應(yīng)20min ； 步驟2.2，加入30-50mg的NHS，在黑暗中劇烈攪拌lh ； 步驟2.3,向混合液中倒入c (RGDfk)溶液(1-lOmL, 4mg.mL:),室溫下攪拌反應(yīng)12-24h ； 步驟2.4，反應(yīng)后產(chǎn)物用截留量為lOkDa的超濾管離心(3000Xg，20min)，去除過量反應(yīng)物，得到的產(chǎn)物溶于2mL PBS緩沖液(PH7.4，10mM)中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金納米簇(AuNCsOBSA)的制備方法，其特征在于，步驟1.5中所述NaOH溶液的體積為0.5-5mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金納米簇(AuNCsOBSA)制備方法，其特征在于，步驟1.6所述的攪拌持續(xù)時(shí)間12-24h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金納米簇(AuNCsOBSA)的制備方法，其特征在于，步驟1.7中所述透析時(shí)長為12-48h。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RGD-AuNCs@BSA的制備方法，其特征在于，步驟2.1中所述的活化AuNCs所用的EDC為40-60mg。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RGD-AuNCs@BSA的制備方法，其特征在于，步驟2.2中所述的活化AuNCs所用的NHS為30-50mg。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RGD-AuNCs@BSA的制備方法，其特征在于，步驟2.3中所述的c(RGDyK)溶液加入量為1-lOmL。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RGD-AuNCs@BSA的制備方法，其特征在于，步驟2.3中所述的活化后AuNCs和RGD反應(yīng)時(shí)間為12-24h。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RGD-AuNCs@BSA的制備方法，其特征在于，步驟2中金納米簇表面的RGD靶向腫瘤血管的α ν β 3受體，對腫瘤進(jìn)行特異性結(jié)合。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種RGD標(biāo)記的熒光金納米簇的制備方法，所述的方法為：用BSA法制備粒徑小于2nm的金納米粒子；將制備好的金納米簇與帶有氨基的RGD進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到RGD標(biāo)記的熒光金納米簇。本發(fā)明得到的金納米團(tuán)簇(Au？Nanoclusters,AuNCs)是一種新型貴金屬熒光納米材料，具有以下特性：制備條件、步驟簡單，在可見光源下呈近紅外光發(fā)射，粒徑小，單分散性和穩(wěn)定性好，毒副作用小，安全性高，熒光性能穩(wěn)定，CT成像造影分辨率高。αvβ3整合素在大多數(shù)正常組織和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞中僅有少量的表達(dá)，但是在多種癌細(xì)胞和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中過度表達(dá)，其配體稱為RGD多肽序列。本發(fā)明選用RGD作為靶向分子，將AuNCs與RGD多肽序列偶聯(lián)，制備了一種RGD標(biāo)記的熒光金納米簇RGD-AuNCs@BSA。
【IPC分類】A61K47/48, A61K49/00, A61K49/04
【公開號】CN105363043
【申請?zhí)枴緾N201410389874
【發(fā)明人】屈曉超, 李奕辰, 李蕾, 王彥然, 梁敬寧, 梁繼民
【申請人】屈曉超
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月8日