，進(jìn)入腹腔后，可見 大鼠Y形的子宮，沿子宮雙側(cè)探及左右末端卵巢，行結(jié)扎切除術(shù)后，將腹壁逐層縫合。術(shù) 后3天連續(xù)肌注青霉素預(yù)防感染（8萬單位/只）。假手術(shù)組除未行卵巢結(jié)扎切除外，其余 步驟與手術(shù)組相同。于術(shù)后30天開始灌胃治療，大鼠劑量為等體重臨床藥量的6. 25倍。 陽1化]具體如下：阿侖麟酸鋼組灌胃量為8. 2mg/kg，每周一次；巧爾奇D給藥量為 0. 126g/(kg'd)，下午灌胃；本發(fā)明配方lOml/kg，上午灌胃；假手術(shù)組和模型組每只給予生 理鹽水lOml/kg。各組動(dòng)物均在溫度25C，相對(duì)濕度70-80%，通風(fēng)、光照充足的環(huán)境下， 給予普通詞料詞養(yǎng)，自由飲水，自由活動(dòng)。 陽106] 3.取材 陽107] 給藥12周后分別取材，每組10只。W10%水合氯醒麻醉后，由腹主動(dòng)脈取血， 隨后取雙側(cè)腔骨和腰椎骨。所取全血室溫靜置比后，經(jīng)3000rmp離屯、lOmin，取血清，-80°C保存。右側(cè)腔骨W4%中性多聚甲醒固定，左側(cè)腔骨W生理鹽水紗布包裹，封口袋密封后 保存于-20°C，用于檢測骨密度及生物力學(xué)。腰椎骨直接凍存于-80°C冰箱。 陽10引 4、檢測方法 陽109] 4.1骨密度檢測
[0110] 采用雙能X線骨密度儀進(jìn)行左側(cè)腔骨骨密度測定。
[0111] 4. 2骨生物力學(xué)檢測
[0112] 所有左側(cè)腔骨從-20°C低溫冰箱中取出后，回復(fù)到室溫，并保持生理鹽水濕潤。復(fù) 溫后，采用Ξ點(diǎn)彎曲法，將腔骨置于萬能材料試驗(yàn)機(jī)上，支座跨距20mm，W腔骨中點(diǎn)為加力 點(diǎn)，壓力加載速度Imm/min，直至腔骨骨折，其載荷和變形通過電腦描記載荷-變形曲線。測 量腔骨內(nèi)徑、外徑，通過計(jì)算機(jī)記錄分析得出生物力學(xué)指標(biāo)：最大載荷和最大應(yīng)力。
[0113] 4. 3 血清BALP和PICP檢測
[0114] 采用Elisa試劑盒，取酶包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、測試孔和空 白對(duì)照孔，在標(biāo)準(zhǔn)孔中加標(biāo)準(zhǔn)品50ul;測試孔中加入40ul樣品稀釋液后，再加入lOul大鼠 血清樣品；空白孔不加樣。加樣后，用封板膜封板后置37Γ溫育，30分鐘后掲掉封板膜，棄 去液體，甩干。將稀釋20倍后的濃縮洗涂液洗板5次，拍干。然后每孔加入酶標(biāo)試劑50μ1， 空白孔除外。繼續(xù)37°C溫育30min，洗板5次。之后每孔先加入顯色劑A50μ1，再加入顯 色劑Β50μ1，37°C避光顯色15分鐘。加終止液50ul終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色），最 后450nm波長測量各孔的吸光度。
[0115] 4. 40PG、RNAKL蛋白表達(dá)檢測
[0116] 從腰椎骨組織細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)，紫外分光光度法光度計(jì)測定蛋白濃度，聚丙 締酷胺凝膠電泳。電泳后將膠在電轉(zhuǎn)液中浸泡15min，剪取與凝膠面積相等的PVDF膜及兩 張濾紙同樣浸泡于電轉(zhuǎn)液中l(wèi)Omin。將多孔墊片浸透電轉(zhuǎn)液后，安裝電轉(zhuǎn)裝置，順序?yàn)椋宏?極（紅色）、多孔墊片、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、多孔墊片、陰極（黑色）。設(shè)置電轉(zhuǎn)程序： llOv1.5h。之后將PVDF膜置于封閉液中，室溫輕搖化或4°C過夜。用TBST溶液洗膜，加 一抗，二抗，洗膜。最后采用超敏E化化學(xué)發(fā)光試劑盒并用凝膠成像系統(tǒng)檢測結(jié)果。
[0117] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0118] 采用SPSS17. 0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)比較，P< 0. 05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。
[0119] 三結(jié)果 陽120] 1.組間骨密度比較 陽121] 本發(fā)明配方組骨密度在4組中最高，骨密度均明顯高于假手術(shù)組、巧爾奇D組和模 型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異十分顯著（與巧爾奇D組比較t= 2. 4867,P< 0. 023,與假手術(shù)組比較t=3. 3499,P< 0. 01，與模型組比較t= 5. 5133,P< 0. 000)。見表 1。 陽122] 表1、各組骨密度值比較（^ +SD，g/cm2) 陽123]
陽124] 注：與本發(fā)明配方組比較，"*，，表示p< 0. 05,"***，，表示p< 0. 000。 陽125] 2、組間骨生物力學(xué)比較 陽126] 本發(fā)明配方組斷裂點(diǎn)最大載荷顯著高于模型組（t= 2. 4469,P< 0. 05); 陽127] 本發(fā)明配方組斷裂點(diǎn)最大應(yīng)力顯著高于模型組（t= 2. 3521，p< 0. 05)。見表2。
[012引表2、各組大鼠斷裂點(diǎn)載荷、應(yīng)力及應(yīng)變比較+SD) 陽129]
陽130] 注：與本發(fā)明配方組比較，表示P< 0.05。
[0131] 3、組間血清BALP和PICP比較
[0132] 各組大鼠I型原膠原C端前膚（PICP)、血清骨堿性憐酸酶度AL巧濃度比較，本發(fā) 明配方組BALP濃度明顯高于模型組（t= 3. 6435,P< 0. 01); 陽133] 本發(fā)明配方組PICP濃度明顯低于模型組（t= 4. 0491，P< 0.001)。見表3。
[0134] 表3、各組血清BALP、PICP水平比較(立+SD) 陽135]
陽136]注：與本發(fā)明配方組比較，"**"表示p< 0. 01，"*林"表示p< 0. 001。4、組間OPG、RNAKL蛋白表達(dá)比較 陽137]本發(fā)明配方組OPG蛋白濃度明顯高于模型組（t= 2. 1359,P< 0. 05); 陽13引本發(fā)明配方組RNAKL蛋白濃度明顯低于模型組（t= 3.2168，p<0.01)。見表4。 陽139] 表4、各組OPG、RNAKL蛋白表達(dá)水平比較?ilSD)
[0140]
陽14U 注：與本發(fā)明配方組比較，表示p< 0. 05, "**"表示p< 0. 01。 陽142] 結(jié)論
[0143] 上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明配方能夠提高0PG基因的蛋白表達(dá)水平，降低RNAKL基 因的蛋白表達(dá)水平，降低I型原膠原C端前膚（PIC巧水平，提高血清骨堿性憐酸酶度ALP) 水平，顯著提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度，同時(shí)也顯著增強(qiáng)模型大鼠的骨斷裂點(diǎn)的最大 載荷和最大應(yīng)力，提高骨的強(qiáng)度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中藥組合物，其特征在于，按照質(zhì)量份包括以下組分： 赤芍6份~15份，牡丹皮6份~12份，茯苓10份~15份，川芎3份~10份，延胡索3份~ 10份，紅花3份~9份，骨碎補(bǔ)10份~15份，白術(shù)5份~15份，川續(xù)斷9份~15份，陳皮 3份~10份，女貞子10份~20份，甘草3份~10份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中藥組合物，其特征在于，進(jìn)一步 地，該中藥組合物按照質(zhì)量份包括以下組分：赤芍10份、牡丹皮10份、茯苓12份、川芎10 份、延胡索10份、紅花9份、骨碎補(bǔ)15份、白術(shù)8份、川續(xù)斷15份、陳皮5份、女貞子15份、 甘草3份。3. -種治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中藥組合物的制備方法，其特征在于，具體包括以下 步驟： 步驟1，稱量、按照質(zhì)量份稱量以下組分：赤芍6份~15份，牡丹皮6份~12份，茯苓 10份~15份，川考3份~10份，延胡索3份~10份，紅花3份~9份，骨碎補(bǔ)10份~15 份，白術(shù)5份~15份，川續(xù)斷9份~15份，陳皮3份~10份，女貞子10份~20份，甘草3 份~10份； 步驟2,洗曬藥品， 將步驟1制備好的諸藥清除雜質(zhì)洗凈、曬干，借日光消毒； 步驟3,炮制， 取經(jīng)步驟2處理的骨碎補(bǔ)厚片，進(jìn)行砂炒，炒至鼓起，取出，去毛； 取經(jīng)步驟2處理的延胡索，加入定量米醋，拌勻，悶潤至醋吸盡，文火加熱炒干，取出， 篩去碎肩； 取經(jīng)步驟2處理的川續(xù)斷、茯苓、白術(shù)、陳皮、女貞子、赤芍、牡丹皮、紅花、川芎、甘草， 生用，不進(jìn)行炮制； 步驟4,煎煮， 將上述藥物按上述配比將藥物混勻后裝入盛水的容器中，將容器加熱、蒸煮，煮沸30 分鐘，煮好的藥物過濾，濾除藥渣，將藥渣再添水400ml，煮沸10分鐘，然后將兩次藥液混合 制得湯劑，即為治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中藥組合物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中藥組合物，按照質(zhì)量份包括以下組分：赤芍6份～15份，牡丹皮6份～12份，茯苓10份～15份，川芎3份～10份，延胡索3份～10份，紅花3份～9份，骨碎補(bǔ)10份～15份，白術(shù)5份～15份，川續(xù)斷9份～15份，陳皮3份～10份，女貞子10份～20份，甘草3份～10份。本發(fā)明還公開了一種治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中藥組合物的制備方法。本發(fā)明的組合物能減輕骨痛，改善癥狀，提高骨密度，提高患者的生活質(zhì)量，降低了副作用的發(fā)生率，安全性高，從而達(dá)到既能有效治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，又能長期服用的目的。
【IPC分類】A61K36/752, A61P19/10
【公開號(hào)】CN105381039
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510784227
【發(fā)明人】葛繼榮
【申請(qǐng)人】福建省中醫(yī)藥研究院
【公開日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年11月16日