)。
[0193] 為檢測MI^L對細胞完整性的影響和在藥物暴露和撤回后將它自己從藥物效應(yīng)擺脫 的能力，用MPL(0、5、10、25iiM)解育細胞72小時，PBS洗涂，將其轉(zhuǎn)移到瓊脂平板，與生長培養(yǎng) 基一起培養(yǎng)并且在標準的條件下解育2周。然后用100%甲醇固定細胞并且用1%結(jié)晶紫染 色。顯微鏡(放大率5倍)下計數(shù)集落(超過50個的細胞簇）。不同試驗組計數(shù)的集落數(shù)量表達 為對照的百分比（圖14)。運些結(jié)果證明了 MI^L對集落形成的濃度依賴的抑制。
[0194] MHii過下調(diào)細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的表達阻滯細胞周期 [01M]為研究MHii過何種機制抑制細胞增殖和集落形成，借助于流式細胞術(shù)檢測MI^L對 細胞周期的影響。發(fā)現(xiàn)M化干擾細胞周期進展（圖3)。暴露于MPL的細胞進展W濃度和時間依 賴性方式被阻滯在Gl期。細胞在Gl期的積累伴隨著S和G2-M期細胞百分比的急劇下降。為研 究設(shè)及MPL誘導(dǎo)的細胞周期阻滯的分子機制，檢測細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cdk2、c化4、細胞周期 蛋白A和E的表達。M化處理的細胞表達低水平的cdk2、(xlk4、細胞周期蛋白A和E(圖4)。
[0196] MHii過下調(diào)細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的表達導(dǎo)致
[0197] PARP-I裂解的誘導(dǎo)來阻滯細胞周期
[0198] 為發(fā)現(xiàn)MI^L通過何種機制抑制細胞增殖和集落形成，借助于流式細胞術(shù)(FACS)檢 測MPL對細胞周期的影響。發(fā)現(xiàn)MPL干擾細胞周期進展（圖22)。暴露于MPL的細胞中，細胞被 W濃度和時間依賴性方式阻滯在Gl期。細胞在Gl期的積累伴隨著S和G2-M期細胞百分比的 急劇下降。為研究設(shè)及MPL誘導(dǎo)的細胞周期阻滯的分子機制，檢測細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cdk2、 C化4、細胞周期蛋白A和E的表達。M化處理的細胞表達更低水平的C化2、C化4、細胞周期蛋白 A和E(圖4和16)。
[0199] M化誘導(dǎo)PARP-I裂解
[0200] 為研究MHJI導(dǎo)的細胞死亡是否設(shè)及PARP的裂解，對MI^L處理的細胞的裂解產(chǎn)物進 行PARP-I和裂解的PARP-I的蛋白質(zhì)印跡分析。PARP-I的裂解通過阻止DNA修復(fù)誘導(dǎo)的存活 促進了細胞調(diào)亡。PARP幫助細胞維持它們的活力并且因此PARP的裂解促進細胞分解并且作 為經(jīng)受細胞調(diào)亡的細胞標識。圖5顯示了PARP在MI^L處理的細胞中被裂解。
[0201] M化誘導(dǎo)PARP裂解
[0202] 從MI^L處理的0VCAR-3和A2780細胞制備的細胞裂解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡分析顯示了 代表細胞死亡的高度誘導(dǎo)的PARP裂解(圖17)。
[0203] MPL降低細胞的ATP水平
[0204] 如圖18A和18B中所述，用MPL處理0VCAR-3或A2780引起細胞中所發(fā)現(xiàn)的ATP水平的 降低。
[0205] M化誘導(dǎo)自體吞隧
[0206] 圖6顯示了 MI^L對細胞的處理導(dǎo)致空泡的形成，運提示MI^L可在運些細胞中誘導(dǎo)自 體吞隧。圖7顯示M化處理降低了 ADP/ATP的細胞比率，運一比率是細胞自體吞隧的另一指 標。
[0207] MI^L抑制裸鼠中皮下異種移植生長率
[020引圖19-21顯示了 MI^L在裸鼠中的體內(nèi)測試。首先腹腔注射處理荷0VCAR-3腫瘤小鼠， 或如根據(jù)最后的試驗，口服地處理。獲得的結(jié)果掲示給藥劑量的活性并且特別是50mg/kg劑 量(腹腔注射和口服的）顯著延遲了運些動物中的腫瘤生長。腫瘤組織學(xué)掲示了大面積的腫 瘤細胞死亡（圖22)。
[0209] 細胞增殖的抑制加上集落形成的抑制，W及體內(nèi)結(jié)果顯示了MI^L的生長調(diào)控效應(yīng)。 通過減少細胞周期調(diào)控蛋白A和E2連同它們的激酶cdk2和cdk4的表達，顯示了 M化干擾細胞 周期進展。在正常的細胞中，從一期到另一期的轉(zhuǎn)換W有序的方式發(fā)生，被各種蛋白很好地 調(diào)控。細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)為關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，其在細胞周期的特定點處被激活 并因此在細胞周期進展中發(fā)揮決定性的作用。運些在細胞周期的不同期需要不同的細胞周 期蛋白。細胞周期蛋白A、D和E為細胞周期的Gl和Gl轉(zhuǎn)換到S期所必需的。在迄今所鑒定的各 種CDK中，CDK2和CDK4似乎是進入Gl和Gl-S轉(zhuǎn)換必不可少的。細胞周期蛋白A和E與CDK2結(jié)合 而細胞周期蛋白D與CDK4和CDK6結(jié)合。癌癥為被認為與細胞周期有關(guān)的現(xiàn)象的幾種疾病的 其中之一。
[0210] 圖19-21中呈現(xiàn)的結(jié)果證明了 MI^L在抑制雌性裸鼠中皮下腫瘤生長的活性。最初的 試驗掲示了腹腔注射M化給藥的劑量依賴性活性。25mg/kg劑量是特別有效的。在此基礎(chǔ)上， 在相同的條件下如W前的使用25和50mg/kg劑量進行下一試驗。50mg/kg劑量在延遲運些動 物中的腫瘤生長方面更有效。作為抗寄生蟲制劑，在許多動物模型中MI^L已顯示了口服地有 效。檢測MPL的50和1 OOmg/kg劑量的口服治療活性。在所有S個前導(dǎo)性試驗中，MPL均制備于 0.5 %HPMC并且作為懸浮液給藥。來自于運些的體內(nèi)試驗中腫瘤組織的檢測掲示了 MI^L處理 的腫瘤中廣泛壞死區(qū)（圖22)。
[0211] 所觀察的效應(yīng)不限制于卵巢癌，如圖1和2中所示，并且MI^L有效地抑制了代表各種 癌癥的各種細胞系的體外細胞增殖，包括膠質(zhì)瘤、前列腺癌、乳腺癌、間皮瘤、脂肪肉瘤、纖 維肉瘤(見表1和2)。
[0212] 另一重要的發(fā)現(xiàn)為MPL對耐藥性細胞系的活性。卵巢耐藥性細胞、膠質(zhì)瘤替莫挫胺 耐藥細胞和乳腺癌=苯氧胺耐藥細胞都對MPL抗增殖作用敏感。
[0213] 總之，結(jié)果證明了在癌癥細胞系中，MPL及潛在地其代謝物和類似物(AAD):
[0214] 1-抑制細胞增殖；
[0215] 2-通過煙堿激動劑或括抗劑預(yù)處理，MPk誘導(dǎo)的抑制既不積極地也不消極地受影 響，運提示作用模式非煙堿受體介導(dǎo)的；
[0216] 2-抑制集落形成；
[0217] 3-阻滯細胞周期[Gl期];
[0218] 4-下調(diào)細胞周期調(diào)控蛋白（0?2、(：化4、細胞周期蛋白4、細胞周期蛋白6);
[0219] 5-限制胸前參入到細胞而因此抑制DNA合成；
[0220] 6-降低細胞ATP水平；
[0221] 7-引起漸進式自體吞隧，如通過LC3B-I到LC3B-n的轉(zhuǎn)換所確認的；
[0222] 8-在顯微鏡下卵巢癌和膠質(zhì)瘤細胞系中自體吞隧是清晰的；
[0223] 9-MI^L也誘導(dǎo)PARP-I的裂解從而細胞死亡；
[0224] 10-通過體內(nèi)數(shù)據(jù)所確定的顯示了劑量依賴的荷皮下腫瘤裸鼠中腫瘤抑制；
[0225] 11-腹腔注射和口服給藥途徑為有效的；
[0226] 而且，M化抑制對一些標準的化學(xué)療法抵抗的細胞增殖。
[0227] 討論
[022引如表1中所示，也在冊VEC上檢測MPL。發(fā)現(xiàn)ICso值比0VCAR-3中ICso值高約10倍，運 反映了]\ffL對癌細胞比對非癌細胞高的細胞毒性。
[0229] 在集落形成測定中，MPLW濃度依賴性方式抑制生長在瓊脂平板上的卵巢癌細胞 系的集落形成，因此進一步地證明了 MI^L抑制癌細胞生長的功效。
[0230] 而且，顯示了無論[0VCAR-3(突變的）、SK0V-3(無效的）和A2780(野生型）]細胞的 p53狀態(tài)如何，M化都發(fā)揮它的抗癌效果（即使處于不同的效能）。運提示了 MI^L對上皮性卵巢 癌有效，無論它們的腫瘤p53狀態(tài)如何。運一發(fā)現(xiàn)具有重要意義，因為p53突變在各種各樣的 癌癥中是非常常見的。
[0231] 應(yīng)理解的是MPL所顯示的效應(yīng)可擴展至除了卵巢癌之外其他類型的癌癥。
[0232] 哺乳動物的細胞周期取決于Cdk的依次激活。01k2與細胞周期蛋白A和細胞周期蛋 白E復(fù)合調(diào)控通過Gl期的進展和S期的進入。因此，抑制運些調(diào)控蛋白的表達打亂了細胞周 期進展。
[0233] M化對細胞增殖和集落形成的抑制是濃度依賴的。M化借此打亂細胞周期進展的可 能的機制為下調(diào)細胞周期調(diào)控蛋白E和A，細胞周期蛋白依賴性激酶Cdk4與Cdk2,導(dǎo)致Gl阻 滯。作為Gl阻滯的結(jié)果，細胞沒有進展到細胞周期的下一階段，如通過S期和G2-M期中細胞 隨著時間急劇的減少所示。媒介處理組的G2-M期中細胞的百分比高于25測M化處理組中的 那些細胞的百分比3倍多。
[0234] 而且，M化處理的癌細胞系中自體吞隧的證據(jù)強有力地提示經(jīng)由Go期細胞周期阻 滯，細胞不可逆地退出細胞周期。
【主權(quán)項】
1.通式（I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物在制備用于治療一種或多種癌 癥的藥物中的用途：其中所述通式(I)的化合物選自下列化合物中的任何一個：2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述通式（I)的化合物為(R)-對映體或(S)-對映體或 外消旋體。3. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述癌癥與激酶有關(guān)。4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其中所述激酶為細胞周期蛋白依賴性激酶。5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述細胞周期蛋白依賴性激酶為Cdk2或Cdk4。6. 如權(quán)利要求1-5中任一項所述的用途，其中所述癌癥選自W下：惡性腫瘤，包括膀脫 癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、間皮瘤、腎癌、肝癌、包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌的肺癌、頭頸癌、 食道癌、膽囊癌、卵巢癌、膜腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌和包括鱗狀細胞癌的 皮膚癌;淋己系的造血腫瘤，包括白血病、急性淋己細胞性白血病、急性成淋己細胞性白血 病、B細胞淋己瘤、T細胞淋己瘤、霍奇金氏淋己瘤、非霍奇金氏淋己瘤、毛細胞淋己瘤、套細 胞淋己瘤、骨髓瘤和伯克特氏淋己瘤;骨髓系造血腫瘤，包括急性和慢性髓細胞性白血病， 骨髓增生異常綜合征和前髓細胞白血病；間葉細胞源的腫瘤，包括脂肪肉瘤、GIST、纖維肉 瘤和橫紋肌肉瘤；中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、膠質(zhì)瘤和 神經(jīng)銷瘤；W及其他腫瘤，包括黑色素瘤、精原細胞瘤、崎胎瘤、成骨肉瘤、著色性干皮病、角 化棘皮瘤、甲狀腺濾泡癌和卡波濟氏肉瘤。7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述癌癥選自卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或間皮瘤。8. 如權(quán)利要求6或7所述的用途，其中所述疾病為卵巢癌。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于癌癥治療的激酶抑制劑。具體地，本發(fā)明涉及氨基乙腈衍生物(AAD)在癌癥治療中的用途。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/277, A61P35/02
【公開號】CN105534969
【申請?zhí)枴緾N201610041111
【發(fā)明人】D·L·莫里斯
【申請人】皮特尼制藥股份有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2013年3月22日
【公告號】CA2868120A1, CN104364232A, EP2817286A1, EP2817286A4, US9308193, US20150051290, WO2013138863A1