一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及植物源農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品抑菌劑的制備，具體涉及高粱殼和蕎麥殼混合水提金黃色葡萄球菌抑制劑的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素從誕生至今已成為人類(lèi)與畜禽抵御及殺死病原菌的有力武器。天然抗生素及合成、半合成種類(lèi)已有上千種，目前廣泛應(yīng)用畜禽養(yǎng)殖的種類(lèi)有幾十種，盡管抗生素類(lèi)藥物因具有防病治病見(jiàn)效快，提高畜禽生產(chǎn)性能，降低養(yǎng)殖成本等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。但是近年來(lái)，越來(lái)越多的細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，且耐藥性不斷增強(qiáng)，致使臨床感染死亡率不斷增高。
[0003]金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界中，金黃色葡萄球菌可廣泛在空氣、水、土地、塵埃以及動(dòng)物機(jī)體的排泄物中存活。對(duì)動(dòng)物機(jī)體而言，金黃色葡萄球菌主要分布在皮膚、口咽、鼻腔和頭發(fā)上，是一種重要的人畜共患致病菌。它通過(guò)分泌溶血素、腸毒素、殺白細(xì)胞素、血聚凝固酶、表皮剝落毒素等多種毒力因子，可以逃過(guò)宿主細(xì)胞的免疫識(shí)別，是奶牛、奶羊乳房炎的常見(jiàn)致病因素，更是污染人畜食物造成食物中毒的“罪魁禍?zhǔn)住薄?br>[0004]甲氧西林是第一代合成青霉素，用于治療金葡菌感染取得良好效果。由于抗生素在臨床上的廣泛使用甚至濫用，臨床很快就分離到對(duì)甲氧西林耐藥的金葡菌(MRSA)。一份2007年-2014年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，MRSA感染發(fā)病率逐年上升，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌已經(jīng)成為耐藥菌感染的主要病原菌之一。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌除了對(duì)B—內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(青霉素類(lèi)和頭抱菌素及含酶抑制劑的抗生素)產(chǎn)生耐藥外，臨床上分離到的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌同時(shí)還對(duì)氯霉素、氨基苷類(lèi)、林可霉素、四環(huán)素類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素以及喹諾酮類(lèi)藥物也具有不同程度的耐藥性，呈現(xiàn)對(duì)多種抗生素耐藥的特點(diǎn)。MRSA感染在世界范圍內(nèi)面臨嚴(yán)峻局面，迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗金葡菌感染的藥物。因此，尋求安全有效抗生素替代品的抑制劑尤為重要。
[0005]植物抑菌作用是指植物的提取物在體外能抑制防止微生物生長(zhǎng)繁殖或者具有殺滅作用，其機(jī)理主要是干擾微生物的代謝過(guò)程，影響其結(jié)構(gòu)與功能，如干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，影響細(xì)胞膜的通透性，阻礙菌體蛋白質(zhì)的合成和抑制核酸合成等。對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)源藥物，它們價(jià)格低廉，資源豐富，而且毒副作用小或無(wú)，對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)不易產(chǎn)生抗藥性，無(wú)論是在理論方面還是應(yīng)用方面，從植物中篩選抑菌藥物均具有非常重要的意義，已成為科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，受到國(guó)外學(xué)者的廣泛重視。
[0006]我國(guó)是自然資源大國(guó)，植物資源豐富、品種繁多、藥源廣泛，屬純天然有機(jī)物。早在建國(guó)初期，我國(guó)醫(yī)藥工作者就開(kāi)始重視研究藥用植物的抑菌效果，篩選出了一些具有抑菌效果的藥材，但對(duì)非藥用植物的抑菌研究還較少。我國(guó)也是資源浪費(fèi)最嚴(yán)重的國(guó)家，這嚴(yán)重不符合可持續(xù)發(fā)展的基本與要求。為了改善這一現(xiàn)狀，本發(fā)明充分利用農(nóng)作物廢棄資源，變廢為寶，利用生長(zhǎng)于我國(guó)北方，抗逆性強(qiáng)的蕎麥和高粱的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品蕎麥殼和高粱殼，經(jīng)過(guò)混合煎煮水提法獲得抑菌效果顯著的金黃色葡萄球菌抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種植物源農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品抑菌劑。
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，采用高粱殼和蕎麥殼為原料，將洗凈的原料等質(zhì)量混合后，按照常規(guī)的中藥煎煮方法獲得藥液，經(jīng)滅菌后，即得到抑菌劑。
[0009]根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)，本發(fā)明得到的抑菌劑的MBC(最小殺菌濃度)與MIC(最小抑菌濃度)接近，均為0.25g/mL。
[0010]在煎煮過(guò)程中，為了提高提取效率，可能需要在煎煮時(shí)添加較多的水，或者多次煎煮，因此，得到的提取液一般濃度都會(huì)比較低，為了不影響抑菌或者殺菌效果，通常還需要進(jìn)行濃縮，使得藥液的濃度至少達(dá)到0.25g/mL。在不影響藥物活性的情況下，理論上可以濃縮至成固體膏。為了便于儲(chǔ)存以及實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要選擇濃縮至何種濃度，如本發(fā)明的優(yōu)選方案為濃縮至MIC的八倍濃度，即2g/mL。
[0011]本發(fā)明抑菌劑優(yōu)選的制備方法，包括以下步驟:將高粱殼和蕎麥殼按質(zhì)量比1:1混合，混合物與水按質(zhì)量體積比120:1000(g:mL)浸泡10-24小時(shí)，然后強(qiáng)火加熱至微沸后改用文火，保持20-50min ；將煮制液過(guò)濾，收集濾液;濾渣加混合物用水的一半，再次煎煮、過(guò)濾；合并兩次濾液為藥液，將藥液濃縮至濃度為0.25-2g/mL;濃縮液經(jīng)滅菌兩次后，得到水提抑菌劑;滅菌條件為:121°(3，0.110^，高壓蒸汽滅菌2011^11;兩次滅菌間隔2411。
[0012]上述制備方法中，混合物與水的混合比例為優(yōu)化的配比，水太少不能將有效成分充分提取，造成原材料浪費(fèi);水太多則濃縮工序費(fèi)時(shí)。但是水的添加量只要能夠保證正常的藥物提取，就不會(huì)影響本發(fā)明所述的抑菌劑的效果。多次煎煮的目的也是為了充分提取出有效成分，因此是否進(jìn)行二次煎煮濾渣或者多次煎煮濾渣都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇的。滅菌的方式和具體條件也同樣不是影響本發(fā)明抑菌劑效果的主要因素。
[0013]影響本發(fā)明抑菌劑效果的主要因素是藥液的濃度。藥液的濃度高于MBC或者M(jìn)IC就可以。本發(fā)明在優(yōu)選方案中將藥液濃度限定為0.25-2g/mL，是為了研究和使用方便。實(shí)際將藥液濃縮至更高濃度或者直接做成活性干粉，也是可以的。
[0014]本發(fā)明的抑菌劑主要用途是用作金黃色葡萄球菌的抑菌劑或者殺菌劑。
[0015]試驗(yàn)組設(shè)置:
組別I是蕎麥殼單獨(dú)水提液；
組別2是高粱殼單獨(dú)水提液；
組別3是蕎麥殼與高粱殼單獨(dú)水提液的混合物(蕎麥殼單獨(dú)水提液與高粱殼單獨(dú)水提液濃縮為各15mL，比例為1:1);
組別4是蕎麥殼與高粱殼混合水提液(本發(fā)明所述的抑菌劑)。
[0016]單獨(dú)水提液的制備方法按照如下步驟:取蕎麥殼或者高粱殼60g，裝于100ml燒杯中，加入蒸餾水100mU浸泡過(guò)夜；強(qiáng)火加熱至微沸后改用文火，保持30min;使用六層紗布過(guò)濾，收集濾液;殘?jiān)铀?00mL，按上法煎煮過(guò)濾，合并兩次濾液;使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)濾液進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至藥液為30mL，即藥液濃度為2g /11^，在121°(3，0.11?&，高壓蒸汽滅菌20min，24h后再滅菌一次，于4°C冰箱中保存，備用。
[0017]混合水提液的制備方法按照如下步驟:取蕎麥殼、高粱殼各60g，裝于1000ml燒杯中，加入蒸餾水100mL，浸泡過(guò)夜；強(qiáng)火加熱至微沸后改用文火，保持30min;將煮制液使用六層紗布過(guò)濾，收集濾液;濾渣加水500mL，同上法再次煎煮過(guò)濾，合并兩次濾液;使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)合并濾液進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至30mL，即藥液濃度為2g/mL，在121°C，0.1MPa，高壓蒸汽滅菌20min，24h后再滅菌一次，于4°C冰箱中保存，備用。
[0018]1、高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC(最小抑菌濃度)的測(cè)定本發(fā)明采用平皿打孔法測(cè)定和二倍稀釋法，用無(wú)菌水依次稀釋不同組別提取液1/2、1/
4、I /8、I /16倍，即最終藥液濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125g/mL。
[0019]在無(wú)菌條件下，用移液槍吸取供試金黃色葡萄球菌液80yL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用涂布器均勻涂布，待菌液吸收5分鐘，加入50yL不同稀釋濃度的提取物，靜置2h后于37°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果并測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果顯示高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC是0.25g/mL，抑菌圈的直徑為2.65cm。
[0020]2、高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC(最小殺菌濃度)的測(cè)定分別取2、1、0.5、0.25、0.1258/1^濃度的高粱殼和蕎麥殼混合水提液10(^1^并加入100
yL過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌菌液，菌液用酶標(biāo)儀測(cè)0D600值=0.4 (相當(dāng)于5X 108CFU/mL)，吹打、混合均勻菌液和混合提取物后靜置于37°C溫箱培養(yǎng)24h后，將每孔的細(xì)菌吹打均勻后導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，無(wú)菌株生長(zhǎng)的最低濃度為菌株的MBC值，試驗(yàn)需要重復(fù)3次，取其平均值，以不加藥物的菌懸液作為陽(yáng)性對(duì)照，本發(fā)明中高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度測(cè)定為0.25g/mL0[0021 ] 3、高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響
取0.125g/mL濃度的高粱殼和蕎麥殼混合水提液100yL，并加入900yL營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，以無(wú)菌水代替混合水提液加入900yL營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。培養(yǎng)5h后，每隔0.5h測(cè)菌液吸光度0D600ο以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液吸光度為縱坐標(biāo)，描繪細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。與空白對(duì)照相比，在高粱殼和蕎麥殼混合水提液作用下，金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間點(diǎn)和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延續(xù)時(shí)間未有明顯改變，但生長(zhǎng)受到明顯抑制，無(wú)法達(dá)到生長(zhǎng)高峰。
[0022]現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)高粱醇提物的抑菌活性、假高粱揮發(fā)油的抑菌活性和蕎麥殼水提物的抑菌活性進(jìn)行了研究。但未有將二者共同研究的報(bào)道。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，將高粱殼和蕎麥殼混合后進(jìn)行水提，得到的藥液的抑菌活性明顯優(yōu)于二者的單獨(dú)水提液或者單獨(dú)水提后的混合液。高粱殼和蕎麥殼混合后進(jìn)行水提具有協(xié)同作用，能夠顯著提高水提液的抑菌或殺菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌或殺菌效果遠(yuǎn)好于二者的單獨(dú)水提液或者單獨(dú)水提后的混合液。
[0023]對(duì)本發(fā)明所涉及的藥液的濃度進(jìn)行解釋如下:由于中藥煎劑的藥物濃度不容易計(jì)量，在有效成份不能完全確認(rèn)的情況下，中藥煎劑的藥液濃度一般以每毫升藥液相當(dāng)于含有原生藥的重量計(jì)量。例如，本發(fā)明的抑菌劑制備，高粱殼60g、蕎麥殼60g，加水100mL煎煮、過(guò)濾后的藥液濃縮至30mL，則每毫升藥液相當(dāng)于含有原生藥量高粱殼2g、蕎麥殼2g。若為單獨(dú)水提液，同樣的制備條件，每毫升藥液相當(dāng)于含有原生藥量高粱殼2g或者蕎麥殼2g。該濃度計(jì)量方式是本領(lǐng)域的常規(guī)方式，簡(jiǎn)記為g/mL的濃度單位形式，由于本發(fā)明所述的兩種原料質(zhì)量比為1:1，為了表述方便，將藥液的濃度記為**g/mL的形式，其實(shí)際指的是每毫升的藥液中含有相當(dāng)于兩種原料的生藥量為各**g。
【附圖說(shuō)明】
[0024]下面結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0025]圖1為高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC的測(cè)定(中央對(duì)照為水)。