[0026]圖2為高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC的測(cè)定(中央對(duì)照為濃度0.125g/mL的提取液)。
[0027]圖3為高粱殼和蕎麥殼單獨(dú)水提液的混合物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC的測(cè)定(中央對(duì)照為水)。
[0028]圖4為高粱殼單獨(dú)水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC的測(cè)定(中央對(duì)照為水)。
[0029]圖5為蕎麥殼單獨(dú)水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC的測(cè)定(中央對(duì)照為水)。
[0030]圖6為高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0031 ]以下結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)過程對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0032]1、材料
本發(fā)明所用蕎麥殼及高粱殼均采購自山西省忻州市五臺(tái)縣。金黃色葡萄球菌菌種(ATCC 26003)購自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。
[0033]2、試劑
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(天津市英博生化試劑有限公司)；牛肉膏、蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；氯化鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；氫氧化鈉(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。
[0034]3、主要儀器
MP4002型電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);C21-SDHCB15型超薄電磁爐(浙江紹興蘇泊爾股份有限公司);RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-B型循環(huán)水式多用真空栗(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；BCD-217B/V型冷藏冷凍箱(青島海爾股份有限公司);HRHPY-100型恒溫培養(yǎng)搖床、HRHH-150SC型恒溫恒濕箱:青島海爾特種電冰柜有限公司；SUNRI SE型酶標(biāo)儀(T-CAN上海貿(mào)易有限公司);YXQ-LS-30SII型立式壓力蒸汽滅菌器;YE4A316580型移液槍(容量:10-1OOiiL) ο
[0035]4、實(shí)施步驟
4.1、高粱殼和蕎麥殼單獨(dú)或混合水提液的制備與試驗(yàn)組別設(shè)置:
單種植物水提法:取蕎麥殼、高粱殼各60g，分別裝于100mL燒杯中，加入蒸餾水100mL，浸泡過夜;強(qiáng)火加熱至微沸后改用文火，保持30min;使用六層紗布過濾，收集濾液；殘?jiān)铀?00mL，按上法煎煮過濾，合并兩次濾液;使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)濾液進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至30mL，即藥液濃度為2g/mL生藥，在121°C，0.1MPa，高壓蒸汽滅菌20min，24h后再滅菌一次，于4°C冰箱中保存，備用。
[0036]混合植物水提法:取蕎麥殼、高粱殼各60g，裝于100mL燒杯中，加入蒸饋水100mL，浸泡過夜;強(qiáng)火加熱至微沸后改用文火，保持30min;將煮制液使用六層紗布過濾，收集濾液;濾渣加水500mL，同上法再次煎煮過濾，合并兩次濾液;使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)合并濾液進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至30mL，即藥液濃度為2g/mL，在121°C，0.1MPa，高壓蒸汽滅菌20min，24h后再滅菌一次，于4°C冰箱中保存，備用。
[0037]試驗(yàn)組的設(shè)置:
組別I是蕎麥殼單獨(dú)水提液，每毫升水提液相當(dāng)于含有蕎麥殼2g;
組別2是尚梁殼單獨(dú)水提液，每暈升水提液相當(dāng)于含有尚梁殼2g;
組別3是蕎麥殼與高粱殼單獨(dú)水提液混合物，蕎麥殼單獨(dú)水提液與高粱殼單獨(dú)水提液濃縮為各15mL，比例為1:1混合，每毫升混合物相當(dāng)于含有蕎麥殼2g和高粱殼2g;
組別4是蕎麥殼與高粱殼混合水提液，每毫升水提液相當(dāng)于含有蕎麥殼2g和高粱殼2g。
[0038]4.2、培養(yǎng)基的制備:
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，在121°C，0.1MPa，高壓蒸汽滅菌20min，并適量灌制于滅菌后的培養(yǎng)皿中。
[0039]4.3、菌種的復(fù)蘇與活化培養(yǎng)
將金黃色葡萄球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂的固體培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)，取I個(gè)d>lmm的菌落于5mL無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，37°C搖床50rmp過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0040]4.4、不同組別水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC(最小抑菌濃度)和MBC(最小殺菌濃度)的測(cè)定
本發(fā)明采用二倍稀釋法稀釋藥液，分別用移液槍吸取2g/mL不同組別的提取液或者提取液混合物，用無菌水依次稀釋1/2、1/4、1/8、1/16倍，即最終藥液濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125g/mL0
[0041]本發(fā)明最小抑菌濃度采用平皿打孔法測(cè)定。在無菌條件下，用移液槍吸取供試金黃色葡萄球菌液80μ1于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用涂布器均勻涂布，待菌液吸收5分鐘，用直徑為4.4mm的打孔器在每個(gè)平皿培養(yǎng)基上等距離打孔，中心I孔，外圍4孔，去除孔內(nèi)瓊脂。每個(gè)組別分別在外圍4孔中加入50μΙ^?度分別為2、1、0.5、0.25 g/mL的提取物，中心一孔加入等量無菌水作為對(duì)照，每個(gè)濃度藥液對(duì)試驗(yàn)菌均做3個(gè)平行試驗(yàn)，靜置2h后于37°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果并測(cè)定抑菌圈直徑，抑菌圈直徑取其平均值。
[0042]結(jié)果顯示不同組別抑菌圈直徑大小為:組別1<組別2 -組別3<組別4。蕎麥殼的抑菌效果(圖5)次于高粱殼(圖4)，MIC是2g/mL，抑菌圈的直徑為0.9cm;蕎麥殼和高粱殼單獨(dú)提取物的簡(jiǎn)單混合液抑菌效果(圖3)與高粱殼的基本一致，MIC是lg/mL，抑菌圈的直徑為1.28cm;組別4高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果(圖1)最好，MIC是0.25g/mL，抑菌圈的直徑為2.65cm。
[0043]MBC(最小殺菌濃度)的測(cè)定，分別取1、0.5、0.25、0.125g/mL濃度不同組別的水提液100yL，并加入10yL過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌菌液，菌液用酶標(biāo)儀測(cè)0D600值=0.4 (相當(dāng)于5 X 108CFU/mL)，吹打、混合均勻菌液和混合提取物后靜置于37°C溫箱培養(yǎng)24h后，將每孔的細(xì)菌吹打均勻后導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，無菌株生長(zhǎng)的最低濃度為菌株的MBC值，試驗(yàn)需要重復(fù)3次，取其平均值，以不加藥物的菌懸液作為陽性對(duì)照。
[0044]結(jié)果顯示:蕎麥殼單獨(dú)水提液只有抑菌效果，沒有殺菌效果;高粱殼單獨(dú)水提液或與蕎麥殼單獨(dú)水提液的簡(jiǎn)單混合物在濃度為2g/mL時(shí)有殺菌效果，而組別4高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度測(cè)定為0.25g/mLo
[0045]根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，采用蕎麥殼和高粱殼混合進(jìn)行水提，得到的水提液的抑菌效果和殺菌效果均具有顯著的優(yōu)勢(shì)。
[0046]4.5高粱殼和蕎麥殼混合水提液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響
取0.125g/mL濃度的高粱殼和蕎麥殼混合水提液100yL，并加入900yL營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，以無菌水代替混合水提液加入900yL營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。培養(yǎng)5h后，每隔0.5h測(cè)菌液吸光度0D600ο以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液吸光度為縱坐標(biāo)，描繪細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。如圖6所示，與空白對(duì)照相比，在高粱殼和蕎麥殼混合水提液作用下，金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間點(diǎn)和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延續(xù)時(shí)間未有明顯改變，但生長(zhǎng)受到明顯抑制，無法達(dá)到生長(zhǎng)高峰。
[0047]本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說明而不能限制發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何變化，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于:為高粱殼和蕎麥殼按1:1混合后，經(jīng)加水浸泡、煎煮、過濾、濃縮、滅菌所得的藥液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于，所述藥液每ImL含有相當(dāng)于原生藥量:高粱殼0.25-2g以及蕎麥殼0.25_2g。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于按照以下步驟制備而成:將高粱殼和蕎麥殼按質(zhì)量比I: I混合，混合后的原料加水浸泡10-24小時(shí)，然后強(qiáng)火加熱至微沸后改用文火，保持20-50min;將煮制液過濾，收集濾液;將濾液進(jìn)行濃縮，濃縮后的ImL藥液含有相當(dāng)于原生藥量:高粱殼0.25-2g、蕎麥殼0.25-2g;濃縮的藥液經(jīng)滅菌后，得到水提抑菌劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于:混合后的原料與水按質(zhì)量體積比g:mLS卩120: 1000加水浸泡。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于:滅菌至少一次，滅菌條件為:121°C，0.1MPa，高壓蒸汽滅菌20min;兩次滅菌間隔24h。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于:所述抑菌劑用作金黃色葡萄球菌的抑菌劑。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于:所述抑菌劑用作金黃色葡萄球菌抑菌劑的濃度為不低于0.25g/mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于:所述抑菌劑用作金黃色葡萄球菌的殺菌劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，其特征在于:所述抑菌劑用作金黃色葡萄球菌殺菌劑的濃度為不低于0.25g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物源農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品抑菌劑的制備，具體涉及高粱殼和蕎麥殼混合水提金黃色葡萄球菌抑制劑的制備；所要解決的技術(shù)問題是提供一種植物源農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品抑菌劑；為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種高粱殼和蕎麥殼混合水提抑菌劑，采用高粱殼和蕎麥殼為原料，將洗凈的原料等質(zhì)量混合后，按照常規(guī)的中藥煎煮方法獲得藥液，經(jīng)滅菌后，即得到抑菌劑；根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)，本發(fā)明得到的抑菌劑的MBC與MIC接近，均為0.25g/mL；高粱殼和蕎麥殼混合后進(jìn)行水提具有協(xié)同作用，能夠顯著提高水提液的抑菌或殺菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌或殺菌效果遠(yuǎn)好于二者的單獨(dú)水提液或者單獨(dú)水提后的混合液。
【IPC分類】A61P31/04, A61K36/899
【公開號(hào)】CN105535598
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511004194
【發(fā)明人】武曉英, 喬宏萍, 郝雪峰, 王青, 吳麗華, 曹貴東, 張建新
【申請(qǐng)人】太原師范學(xué)院
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日