神經(jīng)干細(xì)胞在介導(dǎo)影響p25和p35蛋白表達(dá)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及神經(jīng)干細(xì)胞在介導(dǎo)P25和P35蛋白表達(dá)從而促進(jìn)缺血缺氧性腦病新生大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]圍產(chǎn)期窒息所致缺氧缺血性腦病(hypoxic-1schemic encephalopathy，HIE)是一種常見的腦損傷疾病，該病是新生兒期危害最大的常見病之一，常引起新生兒死亡和嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國新生兒HIE發(fā)生率約為活產(chǎn)兒的3%。?6%。，其中15%?20%在新生兒期死亡，存活者中20%?30%可能遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。另外，還有包括阿爾茨默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病等各種神經(jīng)變性疾病，已嚴(yán)重威脅人類的健康，
目前為止，針對腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，尚無有效的治療手段。研究顯示，P35和P25蛋白是細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5(Cdk5)的調(diào)節(jié)亞基，Cdk5在哺乳動物海馬神經(jīng)元的學(xué)習(xí)和記憶功能中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，CDk5在p35等調(diào)節(jié)亞基的信號作用下錨定于膜上，磷酸化膜性底物，通過平衡促凋亡和促存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在神經(jīng)元發(fā)育、迀移、神經(jīng)元存活中發(fā)揮重要作用。也有研究顯示，P35蛋白是大腦皮層中cdk5的特異性激活劑，能夠被鈣激活中性蛋白(calpain)分解為P25并與cdk5結(jié)合使之激活，參與神經(jīng)細(xì)胞的歉意、分化、細(xì)胞凋亡和信號傳導(dǎo)等過程。而Cdk5在多種人類神經(jīng)退行性疾病中起非常重要的作用，可能是構(gòu)成包括阿爾茨默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病等神經(jīng)變性疾病的主要分子病理基礎(chǔ)。
[0003]因此，針對P35和P25蛋白的調(diào)控從而治療相關(guān)的腦損傷和神經(jīng)變性疾病，是一種探索腦類疾病治療藥物的新方向和有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有HIE等腦損傷或神經(jīng)變性疾病治療技術(shù)的缺陷和不足，提供一種能夠針對調(diào)控P35和P25蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)HIE等腦損傷或神經(jīng)變性疾病治療目的的藥物。本發(fā)明研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)能夠調(diào)控P25、P35蛋白的表達(dá)變化，具體是上調(diào)P35蛋白表達(dá)、下調(diào)P25蛋白表達(dá)，抑制Cdk5的過度激活，從而對腦損傷起到保護(hù)治療作用，對缺血缺氧性腦病等疾病有顯著的療效。
[0005]本發(fā)明的目的是提供神經(jīng)干細(xì)胞在制備P25和/或P35蛋白表達(dá)調(diào)控劑方面的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供神經(jīng)干細(xì)胞在制備腦損傷或神經(jīng)變性疾病治療藥物方面的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明再一目的是提供神經(jīng)干細(xì)胞在制備缺血缺氧性腦病治療藥物方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
神經(jīng)干細(xì)胞在制備P25和/或P35蛋白表達(dá)調(diào)控劑方面的應(yīng)用。
[0009]具體地，是神經(jīng)干細(xì)胞在制備P25蛋白表達(dá)抑制劑方面的應(yīng)用，以及神經(jīng)干細(xì)胞在制備P35蛋白表達(dá)促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。
[0010]神經(jīng)干細(xì)胞在制備腦損傷或神經(jīng)變性疾病治療藥物方面的應(yīng)用。
[0011]其中，所述腦損傷或神經(jīng)變性疾病是指P25和/或P35蛋白參與調(diào)控的腦損傷或神經(jīng)變性疾病。
[0012]更具體地，所述腦損傷或神經(jīng)變性疾病是指缺血缺氧性腦病
另外，在針對缺血缺氧性腦病治療藥物時，所述藥物是指能夠保護(hù)和/或恢復(fù)腦缺血損傷的藥物。
[0013]更進(jìn)一步地，所述藥物是指能夠保護(hù)和/或恢復(fù)腦缺血損傷，且能夠上調(diào)P35蛋白表達(dá)、下調(diào)P25蛋白表達(dá)的藥物。
[0014]本發(fā)明為了探討神經(jīng)干細(xì)胞對P25、P35蛋白表達(dá)變化的影響，以及對缺血缺氧性腦病新生大鼠的治療作用，選取了60只新生7天SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)表法分為3組:SHAM組(對照組):20只，按HIE模型制作過程施予假手術(shù)，不給予其他干預(yù)。HIE+PBS組(缺血組):20只，先制成HIE模型，然后給予I3BS作為安慰治療;HIE+NSC組(治療組)20只，先制成HIE模型，然后給予NSC治療。分別于干預(yù)后第5、7、14、21天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)檢測(Rotarod Test旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮測試)。21日后處死采用組織切片HE染色，觀察新生大鼠腦損傷的病理變化。組織勻漿法提取海馬蛋白，Western blot法檢測海馬區(qū)P35、P25蛋白的表達(dá)。
[0015]Rotarod Test結(jié)果顯示造模后第5天模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅(jiān)持時間明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05);造模后第7、14、21天，模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅(jiān)持時間明顯升高，其中治療組升高趨勢明顯高于缺血組(P〈0.05)，第21天模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅(jiān)持時間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.0ShMorris水迷宮結(jié)果顯示3大鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加而逐漸縮短，前5天的總體學(xué)習(xí)成績的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)。第7天開始治療組時間逐漸縮短，第21天治療組與缺血組大鼠的逃避潛伏期在各個時間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。模型組大鼠出現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元水月中、核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清、空泡形成等病理變化，而治療組病理損傷明顯減輕。Western blot結(jié)果顯示與對照組相比缺血組P35表達(dá)減少，P25表達(dá)增加(P〈0.05)，而治療組與缺血組相比較P35表達(dá)增多，P25表達(dá)減少(P〈0.05)。
[0016]綜上所述，顯示，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)能夠調(diào)控P25、P35蛋白的表達(dá)變化，具體是上調(diào)P35蛋白表達(dá)、下調(diào)P25蛋白表達(dá)，抑制Cdk5的過度激活，從而對腦損傷起到保護(hù)治療作用，可促進(jìn)大鼠缺血腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，對缺氧性腦病等疾病有顯著的療效。因此，上述應(yīng)用均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)能夠調(diào)控P25、P35蛋白的表達(dá)變化，具體是上調(diào)P35蛋白表達(dá)、下調(diào)P25蛋白表達(dá)，抑制Cdk5的過度激活，從而對腦損傷起到保護(hù)治療作用，對缺血缺氧性腦病等疾病有顯著的療效。
[0018]本發(fā)明為HIE等腦損傷或神經(jīng)變性疾病的治療提供了一種新的治療途徑和藥物開發(fā)基礎(chǔ)，給缺血缺氧性腦病等相關(guān)疾病患者帶來新希望。
[0019]另外，本發(fā)明還為研究Cdk5在HIE腦損傷中的作用及神經(jīng)干細(xì)胞的治療機(jī)制提供了新思路，研究結(jié)果揭示了Cdk5在HIE腦損傷中發(fā)揮促凋亡作用，而神經(jīng)干細(xì)胞可以阻斷 Cdk5及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而預(yù)防或減輕HEI腦損傷。
【附圖說明】
[0020]圖1為3組大鼠造模后不同時間點(diǎn)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)檢測結(jié)果。
[0021]圖2為3組大鼠造模后不同時間點(diǎn)逃避潛伏期檢測結(jié)果。
[0022]圖3為3組大鼠造模后第21天海馬腦片HE染色結(jié)果(200倍)。
[0023]圖4為3組大鼠海馬P35和P25蛋白表達(dá)電泳圖。
[0024]圖5為3組大鼠海馬P35和P25蛋白定量表達(dá)分析結(jié)果(*表示P〈0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。
[0026]本發(fā)明實(shí)施例部分的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Student’s t-test進(jìn)行檢驗(yàn)。以P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0027]實(shí)施例1
1、實(shí)驗(yàn)動物及分組:
選擇7日齡SD大鼠60只，雌雄各半，體重50-60g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(SYXK(粵)2011-0074)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:
(1)HIE+PBS組(缺血組):20只，HIE造模成功后PBS作為安慰治療；
(2)SHAM組(對照組)；20只，僅按HIE模型制作過程施予假手術(shù)，不給予其他干預(yù)；
(3)HIE+NSC組(治療組):20只，HIE造模成功后給予NSC治療。
[0028]2、主要儀器設(shè)備與試劑
(I)主要儀器:轉(zhuǎn)棒儀(Rotarod，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，YLS-4C);RD1101-MWM-G鼠博士 MORRIS水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海移數(shù)信息科技有限公司)；海力孚HF-240全自動生化分析儀;立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，68000型);微量注射栗(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，KdSientific 310);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，CX31);電泳儀(瑞典Amersham公司；Ettan DALTsix)；低溫離心機(jī)/凝膠圖像分析儀(美國安萊公司，AlphaEmager2200)。
[0029](2)主要試劑:蛋白酶抑制齊Ij cocktail購自美國sigma公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。P25/P35(C-19)多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；β-actin購自威佳公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自中杉金橋公司;Westernblot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自凱基生物公司；神經(jīng)干細(xì)胞由廣東省臍帶血造血干細(xì)胞庫提供，移植時PBS洗滌細(xì)胞3次，終濃度調(diào)節(jié)為