0.5X 15AiL備用。
[0030]3、HIE模型的建立
實驗大鼠仰臥固定后經(jīng)10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，在解剖顯微鏡下行頸正中切口，分離出右側(cè)頸總動脈后雙重結(jié)扎，并從兩重結(jié)扎線中間剪斷血管，縫合切口。術(shù)后約2?3h將大鼠置于37°C恒溫水浴的密閉缺氧箱中，向缺氧箱中持續(xù)通入8% 02+92% N2的混合氣體，氣流量I L/min，維持1.5h。蘇醒后返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。
[0031 ] 4、腦立體定位儀下側(cè)腦室移植NSCs和PBS的注射
本研究選擇在通過蒼白球中心的鼠腦橫斷切面，以左側(cè)尾狀核為目標區(qū)進行穿刺注射。大鼠腦缺血后24小時，大鼠經(jīng)10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀，頭皮正中切開，分離骨膜，暴露前囟，于顱骨背側(cè)前囟后1.0mm，左旁開3.5mm處鉆一直徑為2.0mm的小孔，大鼠嚴格按照立體定位圖譜，前囟后1.0mm，左旁開
3.5mm，進針深度5.0mm位置進行穿刺。治療組以0.2μ?7π?η的速度恒速注射神經(jīng)干細胞，注射完畢后，留針5min，緩慢移出針頭。以同樣方法注射等量PBS到對照組。
[0032]5、行為學(xué)檢測
(I)旋轉(zhuǎn)實驗(Rotarod test):
實驗裝置有5個隔間，每個隔間的寬度為6.5cm。每個隔間有紅外探測和獨立的測量系統(tǒng)裝置，能檢測到小鼠的跌落情況。程序化控制轉(zhuǎn)棒儀的轉(zhuǎn)速，將實驗鼠放于Rotarod儀上，5min內(nèi)轉(zhuǎn)速逐漸增加(4r/min勾速增加至40r/min)，直至大鼠從Rotarod儀上落下記錄相應(yīng)時間。對每只大鼠進行3次測試，取其平均值與正常大鼠下落時間的百分比作為反映小運動功能的指標，數(shù)值越低，反映大鼠運動功能損傷越嚴重。
[0033]旋轉(zhuǎn)實驗結(jié)果如附圖所示I。造模后第5、7、14、21天時，對照組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間變化趨勢不明顯，基本保持在正常水平，各時間點間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>
0.05);而缺血組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間的變化呈現(xiàn)出先急劇下降后緩慢升高的變化趨勢，各時間點間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。
[0034]造模后第5天起，缺血組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p〈0.05)，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);造模后第7、14、21天，缺血組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間明顯升高，其中治療組升高趨勢明顯高于缺血組，雖與對照組比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)，但在第21天缺血組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅持時間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。
[0035](2)Morris水迷宮實驗
Morris水迷宮由平臺、圓形水池和記錄裝置組成。水池的直徑135cm，高60cm，池壁黑色，將水池分為東北、東南、西南和西北4個象限。平臺置于任意一個象限的中央.每個象限的邊1/2弧度處標記為小鼠入水點。每天開始實驗時，在水池里注水35cm深，水溫維持在(20±5)°C。實驗期間迷宮四周參照物保持不變。水迷宮實驗系統(tǒng)包括CCD攝像頭、視頻采集卡和水迷宮采集分析系統(tǒng)。所有實驗大鼠均進行隱蔽平臺實驗5d、探索實驗ld，以評價各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的變化及干預(yù)后的影響。
[0036]Morris水迷宮實驗結(jié)果如附圖2所示。造模后第5、7、14、21天時，對照組大鼠逃避潛伏期時間變化趨勢不明顯，基本保持在正常水平，各時間點間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而缺血組與治療組大鼠逃避潛伏期時間變化呈現(xiàn)出延長的變化趨勢，各時間點間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。
[0037]造模后第5天起，缺血組與治療組大鼠避潛伏期時間變化與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(？〈0.05)，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(？〈0.05);造模后第7、14、21天，缺血組與治療組大鼠避潛伏期時間有所下降，其中治療組下降趨勢明顯高于缺血組(P〈0.05)，第21天缺血組與治療組大鼠避潛伏期時間變化比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。
[0038]6、HE 染色:
(I)干預(yù)后第21天，每組各取實驗大鼠10只，用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后處死、將腦組織置于4%多聚甲醛中固定48h后進行石蠟包埋及切片，切片厚度為5μπι。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合后，HE染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片觀察。
[0039](2)ΗΕ染色結(jié)果如附圖3所示。結(jié)果顯示對照組大鼠海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)元細胞包膜完整，核大而圓細胞間隙正常，細胞突起清晰可見;缺血組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元水腫、核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清、空泡形成、室管膜細胞重度水腫；而治療組較缺血組損傷較輕，海馬區(qū)神經(jīng)元輕度水腫，未見明顯空泡。
[0040]7Nffestern blot檢測
(I)第21天，每組另取實驗大鼠10只，大鼠稱重，用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后處死，取海馬組織約200mg，加入ImL裂解液，置于冰面上勻漿裂解，勻漿時加入蛋白酶抑制劑cock-tail。在4°C、15000r/min離心lOmin，取上清液。
[0041 ] (2)ffestern blotting分析結(jié)果如附圖4所示，各組大鼠在相對分子質(zhì)量35000、25000位置均顯示一條清晰的黑色條帶，其中治療組、缺血組P35蛋白條帶印跡染色較對照組淺P25蛋白條帶印跡染色較對照組深。
[0042]8、13瓜(1;1^0『(1法進行蛋白定量(13;[0-瓜(1卩1'0七6；[11&88已50
(I)配置10%的SDS-Page膠，將樣品用電泳緩沖液稀釋后煮沸濃縮，按順序加入泳道中。待溴酚藍染料前沿到達分離膠底部，取下凝膠，用B1-Red電轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移完畢，5%脫脂奶粉封閉lh，置于P25/P35抗體(1:1000)稀釋液4°(:下孵育過夜。加ECL(Pieces)發(fā)光劑，于凝膠成像儀中成像，用FluorChem SP軟件對結(jié)果進行分析，β-actin作為內(nèi)參照。
[0043](2)定量分析結(jié)果如附圖5所示:與對照組比較，治療組P35、P25蛋白表達水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);缺血組P35蛋白表達水平較對照組、治療組明顯下降，P25蛋白表達水平較對照組、治療組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。
[0044]綜上所述，本發(fā)明通過結(jié)扎單側(cè)頸動脈構(gòu)建HIE模型，并通過旋轉(zhuǎn)和水迷宮實驗對神經(jīng)干細胞治療新生大鼠HIE損傷動物模型進行了行為學(xué)觀察，研究結(jié)果表明，模型組大鼠與假手術(shù)組相比較運動功能明顯下降，而治療組的運動功能得到明顯的恢復(fù)。病理結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，模型組和治療組在不同時間點皮質(zhì)區(qū)均可見海馬區(qū)神經(jīng)元水腫、核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清、空泡形成，但缺血組相比治療組凋亡細胞數(shù)均逐漸減少。
[0045]同時，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)HIE損傷可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的損傷，并介導(dǎo)P35蛋白表達降低和P25蛋白表達升高。機制為:HIE損傷導(dǎo)致DNA損傷，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活蛋白水解酶，將P35水解為P25和P25-Cdk5復(fù)合物使Cdk5過度激活，使底物過度磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死。而神經(jīng)干細胞可以上調(diào)P3 5蛋白表達，下調(diào)P25蛋白表達，抑制Cdk5的過度激活從而對腦缺血再灌注所造成的損傷起到一定的保護作用。
【主權(quán)項】
1.神經(jīng)干細胞在制備P25和/或P35蛋白表達調(diào)控劑方面的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，是神經(jīng)干細胞在制備P25蛋白表達抑制劑方面的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，是神經(jīng)干細胞在制備P35蛋白表達促進劑方面的應(yīng)用。4.神經(jīng)干細胞在制備腦損傷或神經(jīng)變性疾病治療藥物方面的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述腦損傷或神經(jīng)變性疾病是指P25和/或P35蛋白參與調(diào)控的腦損傷或神經(jīng)變性疾病。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，是神經(jīng)干細胞在制備缺血缺氧性腦病治療藥物方面的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物是指能夠保護和/或恢復(fù)腦缺血損傷的藥物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物是指能夠保護和/或恢復(fù)腦缺血損傷，且能夠上調(diào)P35蛋白表達、下調(diào)P25蛋白表達的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞在介導(dǎo)影響P25和P35蛋白表達中的應(yīng)用，公開了神經(jīng)干細胞在制備P25和/或P35蛋白表達調(diào)控劑方面的應(yīng)用，以及神經(jīng)干細胞在制備缺血缺氧性腦病等腦損傷或神經(jīng)變性疾病治療藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明研究顯示，神經(jīng)干細胞（neural？stem？cells，NSC）能夠調(diào)控P25、P35蛋白的表達變化，具體是上調(diào)P35蛋白表達、下調(diào)P25蛋白表達，抑制Cdk5的過度激活，從而對腦損傷起到保護治療作用，對缺血缺氧性腦病等疾病有顯著的療效。本發(fā)明為HIE等腦損傷或神經(jīng)變性疾病的治療提供了一種新的治療途徑和藥物開發(fā)基礎(chǔ)，給缺血缺氧性腦病等相關(guān)疾病患者帶來新希望。
【IPC分類】A61P9/10, A61K35/30, A61P25/00, A61P25/28
【公開號】CN105560285
【申請?zhí)枴緾N201610015569
【發(fā)明人】田雨光, 顧為望, 王玉玨, 吳清洪, 徐名襯
【申請人】東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月11日