竹節(jié)參皂苷Ⅳa丁酯作為IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】竹節(jié)參皂苷IVa丁酯作為IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域 [0001] :本發(fā)明屬于醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，涉及竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯的醫(yī)藥用途，尤其 涉及竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯作為IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002] ：IL_6是至今為止發(fā)現(xiàn)的功能最為廣泛的細(xì)胞因子之一，人IL-6及其受 體的異常表達(dá)與臨床諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。IL-6是由多種淋巴或非淋巴細(xì)胞產(chǎn) 生，常見(jiàn)的有:T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞 及多種腫瘤細(xì)胞。IL-6作用的靶細(xì)胞廣泛，所以生物學(xué)功能十分復(fù)雜。天然存在的IL-6受體 有兩種:一種是膜結(jié)合受體，另一種是可溶性受體。膜結(jié)合白介素6受體是一糖蛋白，由α，β 兩條鏈組成。α鏈通常稱為IL-6R，是分子量80kDa的配基特異性受體。β鏈稱為GP130,為分子 量130kDa的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。IL-6通過(guò)兩種蛋白（IL-6R、GP130)形成IL-6/IL-6R/GP130六聚 體復(fù)合物后，才可進(jìn)行信號(hào)的傳導(dǎo)，從而發(fā)揮其生物學(xué)活性。IL-6R是介導(dǎo)這個(gè)六聚體復(fù)合 物形成的"中介分子"，它以其胞外區(qū)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)與IL-6結(jié)合后進(jìn)一步偶聯(lián)GP130的胞外區(qū) 并通過(guò)GP130的胞內(nèi)區(qū)將IL-6的信號(hào)傳遞到胞內(nèi)。GP130不能直接與配基IL-6結(jié)合，在生理 情況下，IL-6與IL-6R結(jié)合后使IL-6R的構(gòu)象發(fā)生變化并迅速與兩個(gè)GP130分子結(jié)合，形成高 親和力的復(fù)合物，并通過(guò)GP130亞單位傳遞信號(hào) 【背景技術(shù)】 [Kishimoto等人.Interleukin-6 and its receptor:a paradigm for cytokines·Science·258:593-7(1992)]〇
[0003] 很多疾病發(fā)生過(guò)程中都檢測(cè)到了體內(nèi)IL-6的水平的升高，IL-6及其受體介導(dǎo)的 STAT3信號(hào)通路的活化參與了這些疾病的發(fā)生，這些疾病包括：自身免疫性疾病（自身免疫 性疾病包括:移植排斥，移植物抗宿主疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，及萎縮性側(cè)索硬化，或多發(fā)性 硬化）[Ferguson SD 等人.The role of STAT3 i n tumor-mediated immune suppression. Journal of neuro-oncology. 123:385-94(2015)]，炎性病，骨病，代謝病，神 經(jīng)和神經(jīng)變性病，心血管病，變態(tài)反應(yīng)和哮喘，阿爾茲海默氏病以及癌癥(所訴癌癥包括乳 腺癌，肝癌，肺癌，胃癌，白血病，宮頸癌，腸癌，骨癌，皮膚癌，淋巴癌，卵巢癌，腎癌，神經(jīng)膠 質(zhì)瘤，多發(fā)性骨髓瘤，骨肉瘤，眼癌，鼻咽癌，膀胱癌）[Sansone P,Bromberg J.Targeting the interleukin-6/Jak/stat pathway in human malignancies .J Clin Oncol.30: 1005-14(2012)]。因此研究IL-6抑制劑或其受體拮抗劑是治療上述疾病的有效徑之一。
[0004] 目前已有靶向IL-6R的抗體類藥物，妥珠單抗是第一個(gè)也是唯一的人白介素6受體 詰抗劑單克隆抗體[Hashizume M，et al.Tocilizumab,A Humanized Anti-IL_6R Antibody,as an Emerging Therapeutic Option for Rheumatoid Arthritis:Molecular and Cellular Mechanistic Insights. International reviews of immunology.34:265-79(2015)]，由Π )Α批準(zhǔn)可以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在天然產(chǎn)物中除了一個(gè)報(bào)道發(fā)現(xiàn)從蟾酥中 分離出的化合物ERBF對(duì)IL-6R有拮抗作用能抑制STAT3發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的活性的 [Hayashi M，et al.Biological activity of a novel nonpeptide antagonist to the interleukin-6receptor 20S,21-epoxy-resibufogenin-3-formate. The Journal ofpharmacology and experimental therapeutics.303:104-9(2003)]，其他的天然產(chǎn)物 來(lái)源的IL-6R的拮抗劑非常稀少，更沒(méi)有被批準(zhǔn)用于臨床治療以上疾病的?；谥胁菟幵谖?國(guó)幾千年的用藥傳統(tǒng)及中草藥毒副作用小的特點(diǎn)，從中草藥中發(fā)現(xiàn)天然的，活性好的IL-6R 的小分子類的拮抗劑開(kāi)發(fā)成為臨床上的藥物對(duì)以上疾病的治療具有重大意義。
[0005] 竹節(jié)參阜苷IVa丁酯（ChikusetsusaponinIVa butyl ester)(后簡(jiǎn)寫(xiě)為CS-IVa-Be)結(jié)構(gòu)如下：
[0006]
[0007] 竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯是一個(gè)五環(huán)三萜的皂苷類化合物，分子式是為C46H74〇14，分子 量為850，可以從五加科植物細(xì)柱五加 (Acanthopanaxgraci 1 istylus W·W· Smith)果實(shí)中提 取得到。另有報(bào)道梔子（Gardenia j asm inoidesEllis)[Jing Wang 等人，Three new triterpenoid saponins from root of Gardenia jasminoides Ellis.Fitoterapia,83, 1396-1401(2012)]根以及懷牛膝(AchyranthesbidentataBlume)(祈乃喜，賈淑萍，郝志芳， 李建新.懷牛膝成分的分離與鑒定.中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2005，15(3)，162-166)中也能提取 到該化合物。南京中醫(yī)藥大學(xué)張正光的碩士論文《細(xì)柱五加果實(shí)化學(xué)成分、藥理作用及含量 測(cè)定的研究》對(duì)細(xì)柱五加的藥理作用做了概述，其中提及從細(xì)柱五加果實(shí)分離得到的9個(gè)化 合物，包括竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯，但該化合物的具體藥理活性并未提及。目前，對(duì)于竹節(jié)參皂 苷IVa丁酯的醫(yī)藥用途沒(méi)有任何報(bào)道，其作為一種IL-6R的拮抗劑的作用，即竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯作為IL-6/STAT3信號(hào)通道抑制劑的應(yīng)用更未見(jiàn)任何相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明目的：本發(fā)明公開(kāi)了竹節(jié)參皂苷IVa丁酯作為IL-6R的拮抗劑，可用于制備通 過(guò)拮抗IL-6R并抑制IL-6/STAT3通路能夠改善的疾病的藥物的應(yīng)用。
[0009] 技術(shù)方案:竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯作為IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制劑的應(yīng)用。
[0010] 所述竹節(jié)參皂苷IVa丁酯可以從五加科植物細(xì)柱五加果實(shí)中提取得到，也可以從 梔子根以及懷牛膝中提取。本發(fā)明的竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯優(yōu)選的提取自五加科植物細(xì)柱五 加果實(shí)。
[0011] 所述竹節(jié)參皂苷IVa丁酯作為天然小分子類化合物，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)的IL-6/ STAT3信號(hào)通路的活性，包括組成型的及細(xì)胞因子IL-6引起的STAT3信號(hào)活性。
[0012] 進(jìn)一步地，所述竹節(jié)參阜苷IVa 丁酯是作為IL-6R的詰抗劑。
[0013] 進(jìn)一步地，所述的IL-6R包括IL_6Ra及GP130。
[0014] 進(jìn)一步地，所述通過(guò)抑制IL-6/STAT3通道能夠改善的疾病包括但不限于自身免疫 性疾病、炎性病、骨病、代謝病、神經(jīng)和神經(jīng)變性病、心血管病、變態(tài)反應(yīng)和哮喘、阿爾茲海默 氏病以及癌癥。其中，所述自身免疫性疾病包括但不限于移植排斥，移植物抗宿主疾病，類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，及萎縮性側(cè)索硬化，或多發(fā)性硬化。所述癌癥包括但不限于乳腺癌，肝癌，肺 癌，胃癌，白血病，宮頸癌，腸癌，骨癌，皮膚癌，淋巴癌，卵巢癌，腎癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，多發(fā)性骨 髓瘤，骨肉瘤，眼癌，鼻咽癌，膀胱癌。
[0015] 進(jìn)一步地，所述抑制劑是以竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯為活性成分，采用藥劑學(xué)上可接受 的工藝和輔料制備而成。
[0016] 有益效果：本發(fā)明首次揭示了竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯是一種IL-6R的拮抗劑能抑制 IL-6/STAT3信號(hào)通路，并且竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯是天然的小分子類化合物，來(lái)源廣泛，提取 純化工藝成熟，開(kāi)發(fā)成本低，毒性低，相比蛋白類藥物，其劑型和用藥方式也更加多樣化，具 有廣泛的臨床應(yīng)用前景。 【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖 l:CS-IVa-Be 與 IL-6R 的結(jié)合；
[0018] 圖 1(A) :MST法檢測(cè)CS-IVa-Be與IL_6Ra直接結(jié)合；
[0019] 圖 1(B) :MST法檢測(cè)CS-IVa-Be與GP130直接結(jié)合；
[0020]圖2:ELISA 法檢測(cè) CS-IVa-Be 抑制 IL-6 與IL-6R 的結(jié)合；
[0021] 圖3:細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)CS-IVa-Be抑制MDA-MB-231，Hela以及HepG2細(xì)胞表面IL-6 與其受體的結(jié)合；
[0022]圖4: CS-IVa-Be 抑制 MDA-MB-231 細(xì)胞的STAT3 的磷酸化；
[0023] 圖4(A):CS-IVa-Be抑制MDA-MB-231細(xì)胞組成型的STAT3的磷酸化；
[0024]圖4(B):CS-IVa-Be抑制MDA-MB-231 細(xì)胞IL-6誘導(dǎo)的STAT3的磷酸化；
[0025] 圖5: CS-IVa-Be抑制MDA-MB-2 31細(xì)胞的STAT3下游抗凋亡蛋白的表達(dá)；
[0026] 圖5(A) :CS-IVa-Be抑制MDA-MB-231細(xì)胞組成型的STAT3下游抗凋亡蛋白的表達(dá)；
[0027] 圖5(B): CS-IVa-Be抑制MDA-MB-231細(xì)胞IL-6誘導(dǎo)的STAT3下游抗凋亡蛋白的表 達(dá)；
[0028]圖6: CS-IVa-Be 誘導(dǎo) MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡；
[0029] 圖7: CS-IVa-Be對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抑制活性；
[0030] 圖8:CS-IVa-Be抑制乳腺癌MDA-MB-231裸鼠異種移植瘤的生長(zhǎng)；
[0031 ]圖9:CS-IVa-Be抑制Π 型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎。
[0032] 圖10:CS-IVa-Be抑制Π 型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎脾臟中TNFa，IL-17，IL_10的蛋 白水平。 【具體實(shí)施方式】
[0033]下面主要以乳腺癌細(xì)胞及腫瘤模型以及小鼠關(guān)節(jié)炎模型為例來(lái)說(shuō)明CS-IVa-Be作 為IL-6R拮抗劑抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路的用途。
[0034]實(shí)驗(yàn)材料方法：
[0035]細(xì)胞株:MDA-MB-231，MCF-7，HepG2，MHCC97L，Hela，U937，TF-l，SGC-7901 細(xì)胞均從 中科院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/c雌性裸鼠及DBA/1雄性小鼠均購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 醫(yī)學(xué)部。
[0036] 儀器：BioRad蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，NanoTemper Technologies微量熱泳動(dòng)儀， Mi 11 ipo