re流式細(xì)胞儀，Odyssey焚光掃描儀，Thermo酶標(biāo)儀。
[0037] 試劑:細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基及血清均購買自Thermo公司。Μ?Τ購自Sigma公司，所 有抗體均購自Cell Signaling Technology公司。TNFa，IL-17，IL-10的ELISA檢測試劑盒及 所有涉及到的重組蛋白均購買自R&D公司，基質(zhì)膠購自BD公司，bovine type II collagen 與結(jié)核分枝桿菌H37RA弗式不完全佐劑均購自Chondrex公司。
[0038]實施例1:竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯的制備
[0039] 從細(xì)柱五加中制備CS-IVa-Be的方法:細(xì)柱五加果實4kg，10倍量80%乙醇熱回流 提取2次，每次2小時，10倍量40%乙醇熱回流提取1次為2小時，減壓回收溶劑得乙醇提取物 浸膏，用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取正丁醇部分浸膏，用熱水溶解， 經(jīng)D101大孔樹脂吸附，依次用水、10 %、3 0 %、5 0 %、9 5 %乙醇洗脫。取9 5 %乙醇部分浸膏 13.0g，經(jīng)硅膠色譜、凝膠柱色譜、反相柱色譜分離純化、重結(jié)晶得化合物竹節(jié)參皂苷IVa 丁 酯110mg采用HPLC-ELSD法測定，用歸一化法測得竹節(jié)參皂苷IVa丁酯的純度為98.8%。 [0040]實施例 2: CS-IVa-Be 抑制 IL-6/STAT3 通路 [0041 ] 1、CS-IVa-Be 對 IL-6R 的拮抗作用
[0042] A、不同濃度的CS-IVa-Be與I L_6Ra或GP130混合孵育5分鐘后，使用MST的方法檢測 CS-IVa-Be與IL_6Ra或與GP130的結(jié)合，并計算結(jié)合常數(shù)Kd值。
[0043]結(jié)果顯示：CS-IVa-Be 能直接與 IL-6Ra(Kd = 660± 74nM)或與 GP130(Kd = 1660 土 243nM)結(jié)合，但與IL-6Ra結(jié)合能力更強（圖1)。
[0044] B、不同濃度的CS-IVa-Be與體外重組的IL_6Ra孵育兩小時后，加入一定濃度的IL-6,使用ELISA的方法體外研究CS-IVa-Be抑制IL-6與IL-6Ra的結(jié)合。
[0045] 體外實驗結(jié)果顯示:CS-IVa-Be能顯著地抑制IL-6與其受體IL-6R的結(jié)合(圖2)。 [0046] C、一定濃度的CS-IVa-Be處理MDA-MB-231，Hela及HepG2細(xì)胞8h后，使用生物素標(biāo) 記的IL-6通過細(xì)胞流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測IL-6與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合。
[0047] 結(jié)果顯示:CS-IVa-Be能抑制IL-6與細(xì)胞表面受體IL-6R的結(jié)合(圖3)。
[0048] 2、CS-IVa-Be對組成型及IL-6誘導(dǎo)的STAT3活化的抑制實驗
[0049] 不同濃度的CS-IVa-Be(0，2 · 5，5，7 · 5，10)μΜ處理MDA-MB-231 細(xì)胞8h后使用IL-6 (25ng/mL)刺激15分鐘后，或者不同濃度的CS-IVa-Be(0，5，7.5，10)μΜ處理MDA-MB-231細(xì)胞 24后h提取細(xì)胞全蛋白，使用免疫印跡實驗檢測pSTAT3及STAT3蛋白水平的變化。結(jié)果顯示： CS-IVa-Be能劑量依賴地抑制組成型(A)及IL-6誘導(dǎo)⑶的乳腺癌細(xì)胞STAT3的活化(圖4)。
[0050] 3、CS-IVa-Be對組成型及IL-6誘導(dǎo)的STAT3調(diào)控的下游蛋白水平的抑制實驗 [0051 ]不同濃度的CS-IVa-Be (0，5，7 · 5，10)μΜ處理MDA-MB-231 細(xì)胞24h后，或使用IL-6 (25ng/mL)刺激 15 分鐘后，再用不同濃度的 CS-IVa-Be(0,2.5,5,7.5，10)yM 處理 MDA-MB-231 細(xì)胞24后h提取細(xì)胞全蛋白，使用免疫印跡實驗檢測STAT3下游蛋白（surVi Vin，Bcl-XL， Mcl-l，XIAP，c-FLIP)水平的變化。
[0052] 結(jié)果顯示:CS-IVa-Be能劑量依賴地抑制組成型(A)及IL-6誘導(dǎo)(B)的STAT3調(diào)節(jié)的 下游抗凋亡蛋白的表達(dá)(圖5)。
[0053] 實施例3: CS-IVa-Be誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的實驗
[0054] 不同濃度的CS-IVa-Be (0，5，7.5，10 )μΜ處理MDA-MB-231細(xì)胞24h后，提取細(xì)胞全蛋 白，使用免疫印跡實驗檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Caspase 3，Caspase 8，Caspase 9，PARP)水 平的變化。
[0055]結(jié)果顯不：CS_IVa-Be誘導(dǎo)了凋亡蛋白 Caspase 3，Caspase 8，Caspase 9，PARP的 剪切，表面CS-IVa-Be誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡（圖6)。
[0056] 實施例4:CS-IVa-Be對多種腫瘤細(xì)胞的抑制活性
[0057] 不同濃度的CS-IVa-Be處理MDA-MB-231細(xì)胞24h后，使用MTT法檢測相應(yīng)濃度下CS-IVa-Be對不同腫瘤細(xì)胞的生長抑制率，并計算對不同細(xì)胞抑制作用的IC 5Q值。
[0058]結(jié)果顯示:CS-IVa-Be對多種包括乳腺癌，胃癌，肝癌，白血病在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞 顯示出了抑制活性（圖7)。
[0059] 實施例5: CS-IVa-Be抑制乳腺癌MDA-MB-231裸鼠異種移植瘤的生長
[0000] 乳腺癌異種移植瘤模型建立:6~8周齡Balb/c-nu/nu雌性裸鼠，平均體重18g。處 于對數(shù)生長的MDA-MB-231細(xì)胞，用體積比為1:1的基質(zhì)膠和roS重懸細(xì)胞，稀釋成2X 107個 細(xì)胞/mL的濃度，每只裸鼠從右側(cè)腋下分別注射200yL上述細(xì)胞懸液（即每只裸鼠接種5 X 1〇6個細(xì)胞待腫瘤體積達(dá)到1〇〇_3,將體積過大過小的裸鼠棄用，將成瘤裸鼠隨機(jī)分成模型 對照組、5-FU陽性對照組、竹節(jié)參阜苷IVa 丁酯10mg/kg劑量組、竹節(jié)參阜苷IVa 丁酯20mg/kg 劑量組，每組7只。給藥:5-FU按照10mg/kg/d的劑量，使用腹腔注射方式每周連續(xù)給藥5d，停 藥兩天，持續(xù)4周。竹節(jié)參阜苷IVa丁酯按照低劑量10mg/kg及高劑量20mg/kg，使用灌胃方式 每周連續(xù)給藥6d，停藥ld，持續(xù)4周。給藥結(jié)束后，處死裸鼠，剝離出腫瘤，拍照。
[0061] 結(jié)果顯示:CS-IVa-Be劑量依賴地抑制了腫瘤的生長但沒有明顯的副作用（給藥過 程中幾乎沒有出現(xiàn)死亡），而5-FU化療組雖然抑制腫瘤生長但導(dǎo)致實驗老鼠大量死亡。由此 可見，相比較于化療藥，CS-IVa-Be保留抑瘤活性的同時，沒有顯示出毒副作用（圖8)。
[0062] 實施例6: CS-IVa-Be抑制Π 型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎并抑制關(guān)節(jié)炎小鼠脾臟中促 炎因子TNFa，IL-17，IL-10的蛋白表達(dá)
[0063] 關(guān)節(jié)炎模型建立:6_7周齡的DBA/1雄性小鼠 ，lOOyg bovine type II collagen與 結(jié)核分枝桿菌H37RA弗式不完全佐劑按照1:1比例混合并通過尾靜脈注射。2周后PBS溶解的 二型膠原再次通過尾靜脈加強注射一次。給藥:在造模前6天開始給藥，連續(xù)給藥31天，分為 CS-IVa-Be 10mg/kg及20mg/kg兩個劑量組及一個模型對照組，灌胃給藥，期間對關(guān)節(jié)炎程 度進(jìn)行評分。小鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度評分標(biāo)準(zhǔn):〇分為正常，1分有輕度紅斑，2分指輕度紅斑及 關(guān)節(jié)腫脹，3分指關(guān)節(jié)中度腫脹及紅斑，4分指從腳踝至整個足部出現(xiàn)腫脹紅斑。一周觀測小 鼠足部關(guān)節(jié)三次，進(jìn)行評分，總分為小鼠四肢關(guān)節(jié)炎打分之和。給藥結(jié)束后取脾臟，提取全 蛋白，ELISA法檢測炎癥因子TNFa，IL-17，IL-10的蛋白水平。
[0064]結(jié)果顯示:CS-IVa-Be劑量依賴并顯著地地抑制了 Π 型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎（圖 9)，并且抑制了脾臟中促炎因子TNFa，IL-17，IL-10的蛋白水平（圖10)。
【主權(quán)項】
1. 一種竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯作為IL-6/STAT3信號通路抑制劑的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于：竹節(jié)參皂苷IVa丁酯抑制細(xì)胞組成型的及細(xì) 胞因子IL-6誘導(dǎo)的STAT3信號通路的活性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于:竹節(jié)參皂苷IVa 丁酯作為IL-6R的拮抗劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于:所述IL-6R包括IL-6Ra及GP130。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用是指竹節(jié)參皂苷IVa丁酯作為IL-6/ STAT3信號通路抑制劑改善疾病的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于:所述IL-6/STAT3信號通路抑制劑能夠改善的 疾病包括自身免疫性疾病、炎性病、骨病、代謝病、神經(jīng)和神經(jīng)變性病、心血管病、變態(tài)反應(yīng)、 哮喘、阿爾茲海默氏病以及癌癥。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于:所述自身免疫性疾病包括移植排斥、移植物 抗宿主疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、萎縮性側(cè)索硬化以及多發(fā)性硬化。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于:所述癌癥包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、白血 病、宮頸癌、腸癌、骨癌、皮膚癌、淋巴癌、卵巢癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨肉瘤、 眼癌、鼻咽癌以及膀胱癌。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于:所述竹節(jié)參皂苷IVa丁酯提取自細(xì)柱五加果 實。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述應(yīng)用，其特征在于:所述抑制劑是以竹節(jié)參皂苷IVa丁 酯為活性成分，采用藥劑學(xué)上可接受的工藝和輔料制備而成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種竹節(jié)參皂苷IVa丁酯作為IL-6/STAT3信號通路抑制劑的應(yīng)用，竹節(jié)參皂苷IVa丁酯是一種IL-6R的拮抗劑，具有良好的抑制IL-6/STAT3信號通路的活性，并且能有效抑制此信號通路下游的基因的表達(dá)，因此以竹節(jié)參皂苷IVa丁酯為活性成分，可用于制備基于IL-6/STAT3信號為目標(biāo)的藥物，治療IL-6/STAT3信號通路持續(xù)活化相關(guān)的疾病。所述IL-6/STAT3信號通路持續(xù)活化相關(guān)的疾病包括但不局限于自身免疫性疾病、炎性病、骨病、代謝病、神經(jīng)和神經(jīng)變性病、心血管病、變態(tài)反應(yīng)和哮喘、阿爾茲海默氏病以及癌癥。本發(fā)明揭示了竹節(jié)參皂苷IVa丁酯是一種IL-6R的拮抗劑，并且竹節(jié)參皂苷IVa丁酯是天然的小分子化合物，來源廣泛，提取工藝成熟，開發(fā)成本低，毒性可控，相比蛋白類藥物，其劑型和用藥方式也更加多樣化，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61P37/08, A61K36/254, A61P35/00, A61P19/02, A61P11/06, A61K31/704, A61P29/00, A61P3/00, A61P9/00, A61K36/21, A61P25/00, A61P25/28, A61P19/08, A61P37/06, A61P37/02, A61K36/744
【公開號】CN105582018
【申請?zhí)枴緾N201610107672
【發(fā)明人】曹鵬, 楊杰, 錢士輝
【申請人】江蘇省中醫(yī)藥研究院
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年2月26日