兆帕， 噴霧速度為7.5/s。），粉碎成干浸膏粉，過6號篩，加入上述實施例1制備的甘草配方顆粒2g， 再裝入1號膠囊即可得成品。
[0022] 實施例7:含甘草的植物組合物抑制鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞增殖的實驗研究資料
[0023] 1實驗材料
[0024] 1.1實驗用細胞株
[0025]鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS 常規(guī)培養(yǎng)。
[0026] 1.2實驗藥物
[0027] 研究藥物:本發(fā)明含甘草的植物組合物:按實施例1方法制備。
[0028] 藥液儲液:稱取100mg含甘草的植物組合物，溶于5ml無水乙醇中，0.2μπι濾器過濾， 500μ1 doff管分裝，-20°c存儲，同時0.2μπι濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0029] 1.3實驗試劑
[0030] DMEM(GIBC0公司Cat ·Νο · 12100-061Lot ·Νο · 758137);胎牛血清（浙江天杭生物科 技有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033Lot.No. 1088387) ;Trypsin(AMRES ⑶公司批號：2010/04) ;EDTA(AMRESC0 公司批號： 2009/10) ;Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0 公司批號：2010242) ;Streptomycin Sulfate (AMRESC0公司批號：2010382);無水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司批號： 080310182) ;MTT(Biosharp批號：0793) ;PBS(實驗室自配）；
[0031] 1.4實驗器材
[0032]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司 型號:SPECTRA MAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號:3111);超凈臺（蘇凈集團安泰公司制造型 號：SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司 型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號:DHG9123A);冰箱 (西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠 型號：KA-1000);0 · 2μπι濾器(MILLIP0RE型號：SLGP033RB); 10cm培養(yǎng)皿（NEST公司）、96孔培 養(yǎng)板(NEST公司）；細胞計數(shù)板;離心管、移液管、Tips若干。
[0033] 2實驗方法
[0034] 1)鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng) 皿），當細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25 %胰蛋白 酶-0.04 %EDTA，37 °C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細胞后將其轉(zhuǎn) 入離心管中，lOOOrpm離心5min，調(diào)整細胞懸液濃度3 X 104個/ml。
[0035] 2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180μ1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中 (37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0036] 3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%-70%，加入含甘草的植物組合物溶液，繼續(xù) 培養(yǎng)24h。
[0037] 4)24h 后加入 20μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即0·5%ΜΤΤ)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0038] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0039] 6)同時設(shè)置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液），對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0040] 7)結(jié)果以藥物對細胞的抑制率表示：
[0041 ] 細胞增值抑制率（％ )=(對照孔0D值-給藥孔0D值)/對照孔0D值X 100%。實驗重 復(fù)3次。
[0042] 3統(tǒng)計處理
[0043] 米用Microsoft Excel 2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean土 S.D.表示。
[0044] 4實驗結(jié)果
[0045] MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對鼠神經(jīng)膠質(zhì) 瘤C6細胞增殖抑制有差異(P〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當劑量 達到15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0046] 表1含甘草的植物組合物對鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞增殖抑制影響研究(I 土 SD)
[0047]
[0048] 注：與對照組比較，*P〈0 · 01;林P〈0 · 001
[0049] 5實驗結(jié)論
[0050] 含甘草的植物組合物可以抑制鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞增殖，減少鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細 胞的細胞生長數(shù)目，該作用呈劑量依賴性。
【主權(quán)項】
1. 一種甘草配方顆粒的制備方法，其特征是步驟如下:將甘草洗凈、烘干，并粉碎，放入 連續(xù)逆流超聲提取機中，加入乙醇水溶液后超聲逆流提取，過濾提取液，收集濾液和濾渣， 濾渣再重復(fù)超聲逆流提取2-3次，且每次提取后再過濾，合并濾液，減壓濃縮，回收乙醇，至 60°C時相對密度為1.05-1.25的清膏；醇沉24h，用微孔濾膜過濾，濾液減壓回收乙醇，并濃 縮成60°C時相對密度為1.20-1.30的清膏，減壓真空干燥即得甘草配方顆粒。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的連續(xù)逆流超聲提取機為單級式6節(jié)管，其 中1-2節(jié)為浸泡提取管，3-6節(jié)為超聲提取管，加入為原藥粉8倍量的50 %乙醇水溶液在超聲 波功率為40-80KHZ的室溫條件下每次超聲逆流提取30-45min。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述超聲逆流提取后的合并濾液是在真空度 0 · 85~0 · 95Mpa，60°C減壓濃縮成1 · 05-1 · 25的清膏。4. 一種含有甘草的植物組合物，其特征在于，它所含的活性成分由下列重量份原料配 比制備而成:甘草配方顆粒2份、秋海棠20份、木棉根18份、響葉楊15份、石松子25份，甘草配 方顆粒為上述權(quán)利要求1的方法制備而得。5. 如權(quán)利要求4所述含有甘草的植物組合物，其特征在于，制備方法步驟為:取上述除 甘草配方顆粒外其他藥材合并，加水煎煮兩次，合并煎液，濃縮至65°C時相對密度為1. ΙΟ-?. 20,加入乙醇，攪拌，使含醇量按體積百分比計算達 65-85%，靜置，過濾，濾液減壓濃縮至 65°C時相對密度為1.20-1.30并回收乙醇，將濃縮液噴霧干燥，所得顆粒粉碎成干浸膏粉， 加入甘草配方顆粒和輔料，制成所需制劑。6. 如權(quán)利要求5所述含有甘草的植物組合物，其特征在于，制備方法中煎煮條件為:第 一次加水量為藥材重量的8-12倍量，煎煮1-2h，第二次加水量為藥材重量的6-10倍量，煎煮 1-2h〇7. 如權(quán)利要求5所述含有甘草的植物組合物，其特征在于，制備方法中噴霧干燥條件 為:進風(fēng)溫度為90-110°(：，出風(fēng)溫度為60-90°(：，物料溫度為60-90°(：，霧化壓力為0.2-0.5兆 帕，噴霧速度為1-lOml/s。8. 如權(quán)利要求4所述含有甘草的植物組合物在抑制鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞增殖藥物中的 應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，公開了一種甘草配方顆粒的制備方法，將甘草洗凈、烘干，并粉碎，放入連續(xù)逆流超聲提取機中，加入乙醇水溶液后超聲逆流提取，過濾提取液，收集濾液和濾渣，濾渣再重復(fù)超聲逆流提取2-3次，且每次提取后再過濾，合并濾液，減壓濃縮，回收乙醇，至60℃時相對密度為1.05-1.25的清膏；醇沉24h，用微孔濾膜過濾，濾液減壓回收乙醇，并濃縮成60℃時相對密度為1.20-1.30的清膏，減壓真空干燥即得甘草配方顆粒，并公開以甘草配方顆粒做成復(fù)方，還公開了其在制備抑制鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K36/76, A61K36/484, A61P35/00, A61K9/16
【公開號】CN105582132
【申請?zhí)枴緾N201610126198
【發(fā)明人】李洋
【申請人】南京多寶生物科技有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年3月7日