使吸煙的不利作用減少的新方法
【專利說明】使吸煙的不利作用減少的新方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及健康與醫(yī)藥領(lǐng)域,更具體地,涉及預(yù)防或治療肺疾病(例如C0PD、肺氣 腫和肺癌)的領(lǐng)域,或者,克服吸煙帶來的問題的領(lǐng)域,更具體地,涉及用于減少煙霧吸入的 不利作用的香煙、煙草和其它吸煙材料。
【背景技術(shù)】
[0002] 吸煙有害健康。自從二十世紀(jì)七十年代以來,收集到越來越多的證據(jù)顯示吸煙(尤 其是吸香煙(cigarettes),以及其他形式的吸煙)對吸煙者與未吸煙的旁人的健康的負(fù)面 影響。眾所周知,并且也由多次臨床實驗確定了,香煙煙霧在肺結(jié)構(gòu)的彈性內(nèi)容物(例如,氣 管、支氣管、細(xì)支氣管和肺泡系統(tǒng))的退化中起關(guān)鍵作用。更具體地,肺氣腫是局部肺泡壁損 傷或破壞。
[0003] 肺泡壁中的毛細(xì)管是最重要的解剖學(xué)特征。它們形成纏結(jié)的網(wǎng)絡(luò),并且由富含彈 性和網(wǎng)硬蛋白纖維的精細(xì)的纖維間質(zhì)支持。巨噬細(xì)胞在肺泡空間中發(fā)生,并且形成抵抗入 侵細(xì)菌的第一道防御機制。根據(jù)"彈性蛋白酶:抗彈性蛋白酶"假說,香煙煙霧會導(dǎo)致炎癥, 以及后續(xù)的蛋白水解酶超過其天然抑制劑的規(guī)模向肺中釋放。在缺乏正常修復(fù)的情況下, 蛋白水解導(dǎo)致組織破壞和氣道擴大。該彈性蛋白酶:抗彈性蛋白酶假說已經(jīng)主導(dǎo)了近四十 年的COFO研究。1963年,Laurell和Eriksson(Laurell CB,Eriksson S.Scand J Clin Invest 1963,15:132-140)報道了如下觀察結(jié)果:不生成或生成不足量的α-1-抗胰蛋白酶 (αΙΑΤ)(嗜中性彈性蛋白酶(ΝΕ)的主要抑制劑)的患者發(fā)展早發(fā)性肺氣腫。緊隨其后,Gross 等(Gross P等.Arch Environ Health 1965,11:50-58)將木瓜蛋白酶,一種彈性蛋白酶,慢 慢地輸入大鼠的肺,導(dǎo)致肺氣腫。隨后,研究者們能夠通過將其它彈性酶(包括人嗜中性彈 性蛋白酶)慢慢地輸入實驗動物的氣道來誘導(dǎo)肺氣腫(Senior RM等J Clin Invest 1980, 66:859-862;如11〇打八等^1111^¥1^8?卜018 1977,115:46卜478;5111(16161^等^1111^¥ Respir Dis 1984,129:155-160)??傊@些觀察結(jié)果確證NE作為蛋白酶最有可能引起肺 氣腫中的組織破壞。吸煙的關(guān)系也已由Shapiro等確證(Shapiro S等.Am J Pathol.2003 163(6):2329-2335)。
[0004] 無疑,在多項研究中,已將肺癌的發(fā)生與吸煙相關(guān)聯(lián)。肺癌沒有單一的形式,并且 其可由支氣管癌、肺泡癌、支氣管腺瘤和間充質(zhì)瘤組成。特別是支氣管癌,已將其與吸煙(香 煙)相關(guān)聯(lián)。觀察到該癌癥的解剖學(xué)變化是上皮的變化,例如,毛細(xì)胞損失、基底細(xì)胞增生、 鱗狀細(xì)胞化生和非典型細(xì)胞結(jié)構(gòu)。盡管已經(jīng)顯示彈性蛋白酶抑制會受到存在于香煙煙霧中 并且被證明具有致癌性的化學(xué)化合物(如多芳環(huán)烴)的致癌活性影響,人們假設(shè)彈性蛋白酶 抑制會影響伴隨癌發(fā)生的級聯(lián)事件,例如,癌的免疫組分的作用。
[0005] 盡管已表明彈性蛋白酶抑制劑可用于治療肺氣腫(例如K0rak i,T .等,2002, Am.J.Resp·Crit·Care med·166:496-500;Wright,J.等,2003,Eur·Resp·J·22:77-81),迄 今為止未見這些化合物在肺氣腫領(lǐng)域的商業(yè)應(yīng)用。
[0006] 仍然需要對于具體蛋白酶(例如,彈性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、組織蛋白酶G 等)具有特異性的新型蛋白酶抑制劑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)發(fā)新素(fahsin)可用于預(yù)防選自肺氣腫、C〇ro和肺癌的 肺疾病。例如在治療或預(yù)防肺疾病(具體為肺氣腫)中的應(yīng)用可優(yōu)選地通過吸入,尤其是通 過吸入煙霧(更具體地,煙草(例如香煙)煙霧)來實現(xiàn)。
[0008] 本發(fā)明還包括用于治療或預(yù)防肺氣腫的吸煙制品,例如香煙,包括電子香煙(e-cigarette)、煙斗煙草、雪前或煙卷(joint)。優(yōu)選地,所述吸煙制品包含彈性蛋白酶抑制 劑,優(yōu)選地,選自下組:發(fā)新素、瓜梅素(guamerin)、匹瓜梅素(piguamerin)、希如斯塔辛 (hirustasin)、德拉斯塔辛(^(161138丨38;[11)和瓜梅素的突變體、在第6個半胱氨酸殘基之后 包含亮氨酸殘基的匹瓜梅素、希如斯塔辛和德拉斯塔辛。進一步優(yōu)選地,所述彈性蛋白酶抑 制劑以摻混物形式或由煙草或大麻表達的蛋白質(zhì)形式包含在所述煙草或大麻中?;蛘撸?述香煙是過濾嘴香煙或電子香煙,并且,所述彈性蛋白酶抑制劑存在于過濾嘴中。又或者, 所述吸煙制品是香煙或卷煙,并且所述彈性蛋白酶抑制劑存在于卷煙紙中。
[0009] 在另一個實施方式中,所述彈性蛋白酶抑制劑是重組生成的發(fā)新素。
[0010] 本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)基因煙草或大麻,其包含彈性蛋白酶抑制劑,優(yōu)選地是發(fā)新素。因 此,本發(fā)明包括含有所述轉(zhuǎn)基因煙草或大麻的香煙。
[0011] 本發(fā)明的另一個部分是預(yù)防或減輕肺氣腫、C0PD或肺癌的方法,所述方法包括抽 吸本發(fā)明的吸煙制品。
[0012] 本發(fā)明的另一個實施方式是預(yù)防或減輕肺氣腫、coro或肺癌的方法,所述方法包 括吸入彈性蛋白酶抑制劑,優(yōu)選是發(fā)新素,更優(yōu)選是重組發(fā)新素。
[0013] 本發(fā)明還包括一種改善吸煙者的肺功能的方法,所述方法通過給予彈性蛋白酶抑 制劑,優(yōu)選地通過吸入給予所述抑制劑來進行。優(yōu)選地,在所述方法中,所述吸入是吸入煙 霧,其中所述煙霧包含所述抑制劑。
[0014] 在另一個實施方式中,本發(fā)明提供發(fā)新素、瓜梅素、匹瓜梅素、希如斯塔辛和德拉 斯塔辛的新型突變體。
【附圖說明】
[0015]圖1:五種不同安逖斯塔辛(ant istas in)型絲氨酸蛋白酶抑制劑的一級氨基酸序 列的比對。所述蛋白質(zhì)中具有相似間距的半胱氨酸殘基以粗體表示。反映所述抑制劑的特 異性的反應(yīng)位點(P1)氨基酸殘基以下劃線表示。
[0016]圖2.不同瓜梅素突變體對人嗜中性彈性蛋白酶的抑制。X軸指示突變體P1位的殘 基(met是野生型),空白是僅有底物,而最大(max)是底物+彈性蛋白酶。短線表示自孵育開 始之后的時間。Y軸顯示檢測到的A405-A540的差。
[0017]圖3.不同濃度的發(fā)新素突變體對組織蛋白酶G的抑制。突變體指示和y軸與圖2中 類似。
[0018]圖4.瓜梅素突變體對不同蛋白酶的抑制。A:組織蛋白酶G,B:糜蛋白酶,C:彈性蛋 白酶,D:胰蛋白酶,E:纖溶酶,F(xiàn):凝血酶 [0019]發(fā)明詳述
[0020] 近期發(fā)現(xiàn)的彈性蛋白酶抑制劑之一是發(fā)新素,其源自尼羅河水蛭(Limnatis nilotica)(De Bruin,E.等,F(xiàn)EMS Yeast Res.5:1069-1077,2005;TO 96/13585)。在該公開 文件中已證明,發(fā)新素是對人嗜中性彈性蛋白酶(hNE)具有特異性的蛋白酶,并且是其它重 要的血液源性絲氨酸蛋白酶,例如纖溶酶、凝血酶、tPA、凝結(jié)因子Vila、Xa、XIa和Xlla所無 法比擬的。這使其成為本發(fā)明的理想候選物。
[0021] 此外,盡管發(fā)新素是肽化合物,其在重組技術(shù)的協(xié)助下易于生成,并且已證明其具 有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。所述氨基酸序列(GenBank DQ097891.1)和編碼所述氨基酸序列的核苷酸 序列(GenBank AAY85799.1)已示于圖1。如De Bruin等(同上)所述,發(fā)新素類似于其它安逖 斯塔辛型蛋白酶抑制劑,它們以特定的距離具有10個半胱氨酸殘基的共有序列:
[0022] C(X4)CS(X4)C(X4)CXC(X4)C L(X3)C(X6)DXNGC(X3)CXC
[0023] 其中X可以是任何氨基酸,并且C、L、N、G和C具有其氨基酸命名中的常規(guī)含義。
[0024] 對于NE的特異性歸因于第6個半胱氨酸殘基之后的亮氨酸殘基。認(rèn)為具有上述共 有序列的肽可用于本發(fā)明,并且將具有NE-抑制效應(yīng)。
[0025] 發(fā)新素之外,其它安逖斯塔辛型絲氨酸蛋白酶(NE)抑制劑也可用于本發(fā)明。示例 有:瓜梅素、匹瓜梅素、希如斯塔辛和德拉斯塔辛。這些化合物的氨基酸序列為:
[0026] 瓜梅素(日本醫(yī)輕(Hirudo nipponia)): vdenaedthg lcgektcspa qvclnnecac taircmifcp ngfkvdengc eypctca
[0027] 匹瓜梅素(日本醫(yī)輕):tdcggktcse aqvckdgkcv cvigqcrkyc pngfkkdeng ctfpctca
[0028] 希如斯塔辛(歐洲醫(yī)輕(Hirudo medicinalis)) : tqgntcgget csaaqvclkg kcvcnevhcr irckyglkkd engceypcsc akasq
[0029] 德拉斯塔辛(歐洲醫(yī)輕):f dvnshttpc gpvtcsgaqm cevdkcvcsd lhckvkcehg fkkddngcey acicadapq
[0030] 發(fā)新素的這些替代物中,特別優(yōu)選的是突變的瓜梅素,其中,第6個半胱氨酸殘基 之后的甲硫氨酸殘基被改成亮氨酸殘基:vdenaedthg lcgektcspa qvclnnecac tairclifcp ngfkvdengc eypctca。已顯示(結(jié)果未顯示),所述突變的瓜梅素對化學(xué)和生物 氧化作用均不敏感,并且,該突變的蛋白質(zhì)還似乎是NE分子的強抑制劑(如野生型發(fā)新素)。 據(jù)信,將該特定殘基(參見圖1),其在上述的其它分子中是精氨酸殘基(匹瓜梅素和希如斯 塔辛)或賴氨酸殘基(德拉斯塔辛),改變?yōu)榱涟彼釟埢?,也能夠提供對NE具有提高的反應(yīng)性 的突變蛋白,并且其比野生型蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定。
[0031] 由此,