所述在第6個(gè)半胱氨酸殘基之后具有亮氨酸殘基的突變蛋白也是本發(fā)明的 部分。
[0032] 在研究可用于本發(fā)明的突變體時(shí)制得的其它突變體包括多種發(fā)新素突變體，其 中，P1位點(diǎn)（即，第6個(gè)半胱氨酸殘基之后的殘基)已被改變。制備的若干突變體中，Pl=Arg， 卩1 = 116，？1=1的且？1是￥&1。這些突變體通過定點(diǎn)誘變來制備。發(fā)新素-11 6(8卩，第6個(gè)半胱 氨酸殘基之后的殘基是lie)似乎是對(duì)彈性蛋白酶極具特異性的抑制劑，并且不抑制糜蛋白 酶、組織蛋白酶G和蛋白酶3。這表示，該突變體非常合適于其中特定的彈性蛋白酶是致病因 素的疾病，例如，肺氣腫和牛皮癬。并且，該突變體能夠非常良好地適用于由酶，人嗜中性彈 性蛋白酶(HNE)引起的與組織破壞相關(guān)的關(guān)節(jié)炎、齒齦炎、牙周炎和其它炎性病癥。因此，本 發(fā)明還涉及該發(fā)新素-lie突變體作為治療性化合物的應(yīng)用，尤其是用于治療與嗜中性彈性 蛋白酶相關(guān)聯(lián)的炎性疾病，具體有肺氣腫、牙周炎、關(guān)節(jié)炎等。認(rèn)為，對(duì)于肺氣腫和牙周炎的 治療，優(yōu)選地以經(jīng)口方式進(jìn)行給予。對(duì)于肺氣腫治療，可通過任何形式的吸入器進(jìn)行給予， 但有利的是通過本文所述的電子香煙給予。對(duì)于牙周炎，也可采用電子香煙遞送，但該化合 物也可在牙膏、香口膠或提供該化合物在口腔中的釋放的其它給予形式中提供。
[0033] 同樣地，所述發(fā)新素-Val和發(fā)新素-Met突變體也可以與上述關(guān)于發(fā)新素-lie相同 的方式用作彈性蛋白酶-抑制劑，盡管其效果相對(duì)于發(fā)新素-lie突變體和野生型發(fā)新素而 言特異性較弱。
[0034] 第二種非常有用的發(fā)新素突變體是發(fā)新素-Arg。該化合物，盡管其與野生型發(fā)新 素(無法特異性抑制彈性蛋白酶)僅差一個(gè)氨基酸，但驚人的是，它是胰蛋白酶的極佳抑制 劑(并且其也抑制凝結(jié)因子Xa、XIa和Xlla)。因?yàn)檫@些作用，認(rèn)為發(fā)新素-Arg適用于抑制凝 結(jié)和纖維蛋白溶解。并且，發(fā)新素-Arg可用于治療胰腺炎。發(fā)新素-Arg也是強(qiáng)于其它發(fā)新素 突變體的組織蛋白酶G抑制劑。這意味著它也可被用作組織蛋白酶G抑制劑，因此，其可能有 利于治療或預(yù)防炎癥，特別是導(dǎo)致水腫的炎癥，以治療或預(yù)防光老化。并且，其增強(qiáng)發(fā)新素-Arg的抗血栓形成作用。
[0035] 對(duì)于瓜梅素，除了上述的Leu突變體以外，還已制備在P1位具有Ile、Arg、Lys或Val 的其它突變體(參見圖1)。如上所述，該Leu突變體在抑制人嗜中性彈性蛋白酶方面最為有 效，盡管野生型(P1位為Met)也顯示一些效果。其它三種突變體效果較差。然而，Arg突變體 似乎是糜蛋白酶的最佳抑制劑，Leu突變體名列第二。這兩種也是組織蛋白酶G的最佳抑制 劑。然而，顯示Lys突變體是胰蛋白酶和纖溶酶的特異性抑制劑，而對(duì)于其它突變體，僅瓜梅 素-Arg能夠顯示一些作用。凝血酶幾乎不被任何所述突變體抑制。
[0036]此外，先前設(shè)想的彈性蛋白酶抑制劑在肺疾病(例如coro和肺氣腫)領(lǐng)域中的應(yīng)用 已集中于已經(jīng)確立了肺氣腫之后的應(yīng)用。應(yīng)清楚的是，彈性蛋白酶抑制劑在香煙中的應(yīng)用 是意在預(yù)防肺氣腫的發(fā)作或抑制肺氣腫的進(jìn)一步發(fā)展。因此，本發(fā)明還提供通過發(fā)新素來 預(yù)防肺氣腫或預(yù)防肺氣腫的發(fā)展。
[0037]所述應(yīng)用尤其有利于預(yù)防或減少吸煙(尤其是吸香煙）的有害作用。此外，已證明 (Kozumi，F(xiàn).等，1999，Clin.Pharmacol.Ther，66:501-508)吸煙者的肺對(duì)彈性蛋白酶抑制劑 的攝取可相對(duì)于非吸煙者的攝取而有所增加，這協(xié)助進(jìn)行非常適合于對(duì)抗吸煙的有害作用 的治療。
[0038] 本發(fā)明的NE抑制劑可用于吸入器中，以預(yù)防或治療疾病，例如⑶PD、肺氣腫和肺 癌。此外，NE抑制劑的給予可用于改善或減輕其中肺凝結(jié)或因其它因素而導(dǎo)致長期功能受 損的病癥。這類病癥包括:哮喘、由細(xì)菌或其它微生物所致的肺炎，例如肺炎球菌、葡萄球 菌、流感嗜血桿菌、綠膿假單胞菌、粘膜炎莫拉菌、支原體、肺炎性披衣菌、嗜肺軍團(tuán)菌、呼吸 道合胞病毒(RSV)、腺病毒、衣原體、曲霉菌、普通感冒、由石棉沉著病所致的肺組織破壞或 損傷、空氣污染等。理想地，NE抑制劑（例如發(fā)新素）的吸入可通過吸入，尤其是通過吸入器 的吸入或通過電子煙（電子香煙）的吸入來遞送。
[0039]對(duì)于吸煙者，本發(fā)明的NE抑制劑，尤其是發(fā)新素，具體為重組發(fā)新素，可以任何可 行的方式包括在吸煙制品內(nèi)。首先，所述肽能夠在香煙中所含的煙草或其它植物材料（大 麻）中重組表達(dá)?？衫糜糜讷@得畢赤酵母(Pichia pastoris)中的重組表達(dá)的示例中已用 的相似的表達(dá)構(gòu)建體的重組生成，但當(dāng)然，其需要適應(yīng)于植物中的表達(dá)。
[0040] 有多種方式能夠?qū)⒅亟M核酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，例如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化。然而，除了農(nóng)桿菌(Agrobacterium)感染以外，若想實(shí)踐本發(fā)明，還有其它手段來將 DNA有效遞送至受體植物細(xì)胞。據(jù)信，用于將DNA遞送至植物細(xì)胞的合適的方法實(shí)際上包括 能夠使DNA導(dǎo)入細(xì)胞的任何方法，例如通過DNA的直接遞送，例如通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn) 化，通過干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝?。≒otrykus等，Mol .Gen.Genet ·，199:183-188,1985)，通 過電穿孔(美國專利號(hào)5,384,253)，通過用碳化娃纖維刺激(Kaeppler等，1990;美國專利號(hào) 5，302，523;和美國專利號(hào)5，464，765)，以及通過DNA被覆的顆粒的促進(jìn)(美國專利號(hào)5，550， 318;美國專利號(hào)5,538,877;和美國專利號(hào)5,538,880)。通過應(yīng)用例如這些技術(shù)，實(shí)際上，來 自任何植物物種的細(xì)胞均可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且這些細(xì)胞將發(fā)展成轉(zhuǎn)基因植物。
[0041] 如果采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選采用基本強(qiáng)毒的農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞，例如根癌農(nóng) 桿菌(A.tumefaciens)，示例有菌株A281或及其衍生的菌株，或本領(lǐng)域可得的其它強(qiáng)毒株。 這些農(nóng)桿菌菌株攜帶源自Ti質(zhì)粒pTiBo542的毒力區(qū)域的DNA區(qū)，所述Ti質(zhì)粒pTiBo542包含 virB、virC和virG基因。根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)的毒力(vir)基因產(chǎn)物協(xié)助T-DNA的加 工及其向植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化。Vir基因表達(dá)受virA和virG控制，由此，virA在感知誘導(dǎo)信號(hào) 之后會(huì)通過磷酸化激活virGJirG，進(jìn)而誘導(dǎo)virB、C、D、E的表達(dá)。這些蛋白質(zhì)基因編碼涉及 DNA的轉(zhuǎn)化。認(rèn)為pTiBo542的增強(qiáng)的毒力是由該Ti質(zhì)粒上的高強(qiáng)毒virG基因所致(Chen等 Mol.Gen.Genet 230:302-309,1991)〇
[0042] 在將核酸轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物或植物細(xì)胞之后，必須確定哪些植物或植物細(xì)胞已經(jīng)具有 所述核酸。例如，這可通過采用可選擇的標(biāo)志物或報(bào)告基因來實(shí)現(xiàn)。最廣泛用于植物轉(zhuǎn)化的 選擇性標(biāo)志物或選擇基因有，細(xì)菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptl、nptll和nptlll基因），其 賦予對(duì)選擇劑卡那霉素的抗性，如EP131623所述，和細(xì)菌aphIV基因，如EP186425所述，其賦 予對(duì)潮霉素的抗性。EP 275957公開了來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes)的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的應(yīng)用，其賦予對(duì)除草劑草丁膦的抗性。賦予對(duì)除 草劑草甘膦的相對(duì)抗性的植物基因描述于EP218571。該抗性基于編碼5-烯醇莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因的表達(dá)，其相對(duì)耐受N-磷酸甲基甘氨酸。某些氨基酸例如賴氨酸、 蘇氨酸或賴氨酸衍生物氨乙基半胱氨酸(AEC)和色氨酸類似物如5-甲基色氨酸也可用作選 擇劑，因其以尚濃度施加時(shí)具有抑制細(xì)胞生長的能力。在該選擇系統(tǒng)中，可選擇的標(biāo)志物基 因的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生成過量的氨基酸，這允許轉(zhuǎn)基因在選擇壓力下生長。報(bào)告基因 的合適示例有葡糖苷酸酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、熒光素酶和綠色熒光蛋白（GFP)。
[0043] 或者，轉(zhuǎn)化體可通過分析編碼發(fā)新素的核酸或表達(dá)所述核苷酸序列的發(fā)新素蛋白 質(zhì)的存在來檢測(cè)。
[0044] 作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的替代方式，KMciafiska和Wypi jewski(2001，Acta Biochim.Polon .48-3:657-661)示范了用于完整BY-2煙草培養(yǎng)細(xì)胞的電穿孔法，通過表達(dá)報(bào)告子綠色熒光 蛋白（GFP)的質(zhì)粒的表達(dá)來示范。電穿孔法包括在包含5mM CaCl2、l〇mM NaCl、8.7%甘油、 〇. 4M蔗糖和10mM管道緩沖劑的緩沖系統(tǒng)(pH 6.8)中，在30yg質(zhì)粒存在下，誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)壁分 離15-20分鐘。然后，使細(xì)胞經(jīng)歷真空處理，之后對(duì)其進(jìn)行冰上孵育，隨后通過對(duì)其施加2kV/ cm的脈沖(持續(xù)80 ys)來進(jìn)行電穿孔處理。電脈沖之后，細(xì)胞再次冰上孵育10分鐘，室溫下 放置10分鐘，之后，通過添加不含蔗糖的BY培養(yǎng)基，以在三個(gè)步驟中將蔗糖濃度從0.4Μ降至 0.05M，使細(xì)胞去質(zhì)壁分離。然后，將去質(zhì)壁分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至BY培養(yǎng)基，并在后續(xù)的時(shí)日中 監(jiān)測(cè)GFP表達(dá)。電穿孔之后，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率為50%，而細(xì)胞活力為70%，但在隨后的時(shí)日中降 低。因此，似乎在該過程中，導(dǎo)入DNA的處理對(duì)細(xì)胞的活力和再生能力具有負(fù)面作用。
[0045] 更為巧妙的方法見述于Chen,C.-P.等（2007，F(xiàn)EBS Lett.581:1891-1897)，其采用 基于多聚精氨酸的肽來在完整的綠豆和大豆的根中遞送GFP蛋白質(zhì)和GFP表達(dá)載體。在該示 例中，生成九聚-Arg肽作為載體，并且將10 yg與10 yg的質(zhì)粒在總體積為50 μL的PBS中于 37°C預(yù)先孵育30分鐘。隨后，使綠豆和大豆的根在該DNA-肽溶液中浸沒30分鐘，隨后清洗。 監(jiān)測(cè)GFP的表達(dá)，并顯示其在整個(gè)根的處理之后的24小時(shí)和48小時(shí)之間發(fā)生。
[0046] 可采用表達(dá)編碼本發(fā)明的彈性蛋白酶抑制劑的核酸的其它替代性方法。
[0047] 當(dāng)發(fā)新素在煙草或大麻中重組生成時(shí)，可通過將其與其它煙草摻混或應(yīng)用其本身 來將該煙草或大麻包括在香煙內(nèi)。還可通過將煙草浸沒在彈性蛋