Grf表達(dá)質(zhì)粒在制備降低仔豬出生弱仔率的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及GRF表達(dá)質(zhì)粒在制備降低仔豬出生弱仔率的 藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬肉是我國(guó)肉類消費(fèi)的主要來源，占肉類消費(fèi)的65 %。2014年，我國(guó)豬肉產(chǎn)量達(dá) 5671萬噸，占居世界第一位。因此，生豬生產(chǎn)直接關(guān)系到國(guó)計(jì)民生，有"豬糧安天下"之說。
[0003] 現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)中，我國(guó)的生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)水平較低，特別是母豬的生產(chǎn)水平更為 突出，導(dǎo)致生產(chǎn)養(yǎng)殖成本和資源消耗增加，直接影響生豬養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益和健康發(fā)展，因此 開展提高母豬生產(chǎn)力的工作具有十分重要的意義。我國(guó)每頭母豬每年提供的上市豬的數(shù)量 僅為17-18頭左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)外的26-28頭的水平，成為制約我國(guó)生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)水平的主 要因素。
[0004] 當(dāng)前，困擾著母豬生產(chǎn)水平發(fā)展的問題主要是弱仔問題。有資料表明，我國(guó)豬弱仔 的發(fā)生率在15-20%。造成弱仔的因素很多，包括疾病、營(yíng)養(yǎng)、胎盤效率、管理和環(huán)境氣候因 素等。實(shí)際生產(chǎn)中，人們較多關(guān)心的是疾病因素，而對(duì)妊娠期子宮胎盤的發(fā)育及激素水平的 研究方面，即宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation, IUGR)缺乏足夠的認(rèn)識(shí)和 重視。胎盤能分泌多種激素，如包括絨毛膜促性腺激素、絨毛膜生長(zhǎng)激素(胎盤催乳激素）、 絨毛膜促甲狀腺激素、雌激素和孕激素等，對(duì)于胎兒生長(zhǎng)發(fā)育有重要的作用。通常胎兒初生 重的2/3部分在母豬妊娠后期的1/3的時(shí)段內(nèi)發(fā)育形成，特別是妊娠13~14周至分娩前是胎 兒生長(zhǎng)發(fā)育最快的階段，同時(shí)也是胎兒體能儲(chǔ)備的關(guān)鍵時(shí)期。若母豬在妊娠期胎盤功能不 足，則胎兒在母豬體內(nèi)發(fā)育不良，出生體重小，生長(zhǎng)緩慢，死亡率高，造成弱仔等無效仔豬比 例偏大。因此，胎盤的功能直接關(guān)系到的胎豬在子宮里的正常發(fā)育和生長(zhǎng)。
[0005] 哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育由一系列復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控，它起源于下 丘腦。而下丘腦分泌兩種對(duì)于腦垂體細(xì)胞很重要的肽類:促生長(zhǎng)激素釋放激素 GRF和生長(zhǎng)抑 素 SSTARF作用于腦垂體促進(jìn)生長(zhǎng)激素 GH的分泌，從而增加肝臟和其他組織中胰島素樣生 長(zhǎng)因子類IGF-1的生成，而GH在肝臟以IGF-1的形式促進(jìn)機(jī)體新陳代謝。動(dòng)物在生長(zhǎng)過程中， 動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌生長(zhǎng)軸各因子(激素、受體、結(jié)合蛋白等)及其基因?qū)?dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起著 關(guān)鍵的作用。整個(gè)過程的調(diào)控復(fù)雜，存在著基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、產(chǎn)物的修飾以及各水平的反 饋調(diào)節(jié)機(jī)制。
[0006] 1962年Frantz等發(fā)現(xiàn)豬的下丘腦含有刺激生長(zhǎng)激素分泌的物質(zhì)存在，1964年Due 等用純化或部分純化的下丘腦浸出液加入鼠垂體培養(yǎng)液中，能提高生長(zhǎng)激素的分泌量。 1971年Schally等從豬下丘腦浸出液和垂體門靜脈血中分離出一種10肽，可刺激GH的分泌。 1982年，Guillemin、Ri ver先后分別報(bào)道了胰島細(xì)胞腫瘤及類癌患者有典型肢端肥大癥，且 臨床表現(xiàn)中GH明顯升高而無垂體病變，并由腫瘤組織中成功地提取和純化了具有刺激GH分 泌活性的肽及其降解產(chǎn)物，確定了其一級(jí)結(jié)構(gòu)，其中分子量最大，具有代表性的為44肽，稱 為人膜生長(zhǎng)激素釋放因子（Human pancreatic growth hormone releasing factor, hpGRF)。另外還發(fā)現(xiàn) 了其降解產(chǎn)物，包括 hpGRFl-43、hpGRFl-40、hpGRFl-39、hpGRFl-37、 hpGRFl-32、hpGRFl-29等。以后的研究證明，hpGRF和下丘腦合成的GRF結(jié)構(gòu)完全一致，其成 熟形式為GRF1 - 44 一 NH2。隨著分離純化GRF方法的不斷改進(jìn)，相繼從不同動(dòng)物的下丘腦中 分離到各種GRF，包括豬、牛、山羊和綿羊、鼠的GRF。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已能應(yīng)用多肽合 成和基因工程技術(shù)生產(chǎn)GRF，使對(duì)GRF的研究進(jìn)入了新的階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，有必要針對(duì)仔豬出生時(shí)弱仔率較高、母豬生產(chǎn)水平較低的問題，本發(fā)明 提供GRF表達(dá)質(zhì)粒在制備降低仔豬出生弱仔率的藥物中的用途。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] GRF表達(dá)質(zhì)粒在制備降低仔豬出生弱仔率的藥物中的用途。
[0010] 優(yōu)選地，所述GRF表達(dá)質(zhì)粒為pVAXl-GRF質(zhì)粒。
[0011] 優(yōu)選地，所述降低仔豬出生弱仔率的藥物為注射劑。
[0012] 優(yōu)選地，所述降低仔豬出生弱仔率的藥物為肌肉注射劑。
[0013] 優(yōu)選地，所述降低仔豬出生弱仔率的藥物為孕豬注射藥物。
[0014] 優(yōu)選地，所述孕豬為懷孕60-80天的母豬。
[0015] 優(yōu)選地，所述PVAX1-GRF質(zhì)粒的注射劑量為1~8mg/頭。
[0016]優(yōu)選地，所述pVAXl-GRF質(zhì)粒的注射劑量為4mg/頭。
[0017] -種降低仔豬出生弱仔率的方法，將GRF表達(dá)質(zhì)粒注射入孕豬肌肉組織中，經(jīng)基因 轉(zhuǎn)移后，測(cè)定母豬產(chǎn)仔弱仔率的變化。
[0018] 優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)移利用體外基因轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行，基因轉(zhuǎn)移的電壓為20~40V，脈 沖頻率為4~9Hz，脈沖脈寬為10~100ms。使用電轉(zhuǎn)移技術(shù)增強(qiáng)了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，從而可以使 注射部位的肌肉成為一個(gè)生物反應(yīng)器，用來持久產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)到血液循環(huán)系統(tǒng)中。相 比于用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，在一次注射后電轉(zhuǎn)移可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)水平量增加至少 2~3個(gè)以上數(shù)量級(jí)，并有可能達(dá)到生理所需的水平。
[0019] 優(yōu)選地，所述降低仔豬出生弱仔率的方法包括以下步驟：
[0020] S1.對(duì)懷孕60~80天的母豬后肢肌肉注射pVAXl-GRF質(zhì)粒，注射劑量為1~8mg/頭；
[0021] S2.經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，基因轉(zhuǎn)移的電壓為20~40V，脈沖頻率4~9Hz，脈沖脈 寬10~100ms;
[0022] S3.于妊娠母豬產(chǎn)仔后檢測(cè)仔豬的出生重。
[0023] 更優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)移的電壓為32V，脈沖頻率為8Hz，脈沖脈寬為100ms。
[0024] 肌肉組織可以表達(dá)外源的基因，但表達(dá)效率很低，難于達(dá)到明顯的作用。所以，為 了使肌肉組織高效表達(dá)外源基因，采用提高肌肉組織表達(dá)效率的措施十分重要。SP啟動(dòng)子 是根據(jù)骨骼肌α-actin啟動(dòng)子能在肌肉組織中特異性啟動(dòng)外源基因表達(dá)的這一特性，將骨 骼肌a- actin啟動(dòng)子加以改造，將E-box、MEF-2、TEF-l和SRE序列隨意組合所構(gòu)建的合成啟 動(dòng)子重組庫(kù)中篩選出的一種人工合成啟動(dòng)子，其在肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然肌 肉特異啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子。電穿孔介導(dǎo)轉(zhuǎn)移外源基因的方法是依據(jù)細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué) 等理論，采用微電子及計(jì)算機(jī)技術(shù)，通過設(shè)計(jì)特定的控制電路產(chǎn)生合適的脈沖電流，瞬間改 變靶細(xì)胞的通透性，促進(jìn)DNA、RNA等核酸及蛋白、化學(xué)小分子物質(zhì)快速進(jìn)入細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染 率、增強(qiáng)藥物作用、增加表達(dá)量的效果。使用電穿孔技術(shù)增強(qiáng)了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，從而可以使注 射部位的肌肉成為一個(gè)生物反應(yīng)器，用來持久產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)到血液循環(huán)系統(tǒng)中。在一 次注射后電穿孔轉(zhuǎn)移，相比于用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，這種方法可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)水 平量增加至少2-3個(gè)以上數(shù)量級(jí)，并有可能達(dá)到生理所需的水平。本發(fā)明通過啟動(dòng)子的優(yōu)化 及電轉(zhuǎn)移的方法，可以使外源基因在肌肉組織中的表達(dá)效率大大提高。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0026]本發(fā)明利用肌肉特異性表達(dá)pVAX 1-GRF質(zhì)粒的特性，并通過注射特定劑量的質(zhì)粒 和特定條件下的體外基因轉(zhuǎn)移，使PVAX1-GRF質(zhì)粒在母豬肌肉組織中