高效表達，進而促進胎 兒的發(fā)育，降低了出生仔豬的弱仔率，最終達到提高養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟效益的目的，具有巨大的實 際應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0027] 圖1為pVAXl-GRF質(zhì)粒圖譜。
【具體實施方式】
[0028] 為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】做進一步說明。本發(fā)明中 所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。 [0029]本發(fā)明中使用的GRF表達質(zhì)粒為pVAX 1-GRF質(zhì)粒，其圖譜如圖1所示，通過以下方法 制備：
[0030] (1)稱取的工程菌（大腸桿菌DH5a，pVAXl-GRF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌）菌體10g，重懸于50mL溶 液N(50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，RNaseA 40yg/mL，pH8 · 1)中。然后添加50mL溶液0 (0.12mol/L NaOH，l%十二烷基磺酸鈉（SDS))，于室溫下對菌體裂解5~lOmin。使用20mL 3mol/L的醋酸鉀溶液，于4°C中和裂解液20min。然后將裂解液以5572r/min(8000g)離心 15min，取上清液;將上清液經(jīng)過0.145/0.122μπι囊式過濾器過濾。
[0031] (2)將裝填好的210mL離子交換色譜柱(215cmX 116cm)接入Biologic色譜系統(tǒng)。部 分澄清液體加入1/20體積含20%的1'1'；11:〇11溶液（7501]1111〇1凡他(]1，501]1111〇1凡1'1^8,20% Triton X-100或Triton Χ-114，ρΗ7·10)，稍作攪拌混合后，于4°C靜止lh，然后進行色譜純 化得到實驗組樣品。
[0032]實驗組樣品色譜純化方法：用0.13mol/L NaOH清洗色譜柱，用3倍柱體積含 500mmo 1/L NaCl、50mmo 1/L Tris、15 % (體積分數(shù))異丙醇和0.115 % (體積分數(shù))非離子表 面活性劑的緩沖液(PH7.10)平衡色譜柱，將處理好的樣品置于冰水浴中（0~4°C)用蠕動栗 進行上樣，保持溫度為10~13°C。然后用含625mmol/L NaCl、50mmol/L Tris和15%異丙醇 的緩沖液(PH7.10)淋洗色譜柱至基線平穩(wěn)。接著用含1.125mol/L NaCl、50mmol/LTris和 15 % (體積分數(shù))異丙醇的緩沖液(pH8.15)進行洗脫，線性流速為120cm/h，按照254nm紫外 吸收曲線分峰收集。將洗脫液收集入離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀質(zhì)粒。
[0033] 對照組樣品不進行非離子表面活性劑處理，而且用于平衡色譜柱的緩沖液中不添 加非離子表面活性劑，其他色譜純化條件同實驗組相同。
[0034] 將異丙醇沉淀獲得的質(zhì)粒用75-80%乙醇浸泡60min滅菌，無菌生理鹽水洗滌4次， 再用無菌生理鹽水懸浮質(zhì)粒，調(diào)節(jié)至適當濃度。
[0035] 實施例1
[0036] 將30頭懷孕60天的母豬（大白豬）隨機分成2組，第一組注射生理鹽水lmL，第二組 注射濃度為2mg/mL的質(zhì)粒lmL，注射部位為后肢肌肉。后經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，轉(zhuǎn)移電壓 為32V，脈沖頻率7Hz，脈沖脈寬100ms ;于妊娠母豬產(chǎn)仔后檢測仔豬的體重，按800克為標準 計算弱仔數(shù)及弱仔率，結(jié)果第二組出生體重比第一組提高86克/頭仔豬(P〈0.05)，弱仔率降 低 6·9%(Ρ〈0·05)。
[0037] 實施例2
[0038]將30頭懷孕60天的母豬（大白豬）隨機分成2組，第一組注射生理鹽水lmL，第二組 注射濃度為2mg/mL的質(zhì)粒lmL，注射部位為后肢肌肉。后經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，轉(zhuǎn)移電壓 為30V，脈沖頻率5Hz，脈沖脈寬50ms;于妊娠母豬產(chǎn)仔后檢測仔豬的體重，按800克為標準計 算弱仔數(shù)及弱仔率，結(jié)果第二組出生體重比第一組提高82克/頭仔豬(P〈0.05)，弱仔率降低 5·9%(Ρ〈0·05)。
[0039] 實施例3
[0040]將20頭懷孕75天的母豬（長白豬）隨機分成2組，第一組注射生理鹽水lmL，第二組 注射濃度為3mg/mL的質(zhì)粒lmL，注射部位為后肢肌肉。后經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，轉(zhuǎn)移電壓 為36V，脈沖頻率5Hz，脈沖脈寬40ms;于妊娠母豬產(chǎn)仔后檢測仔豬的體重，按800克為標準計 算弱仔數(shù)及弱仔率，結(jié)果第二組出生體重比第一組提高98克/頭仔豬(P〈0.05)，弱仔率降低 7·8%(Ρ〈0·05)。
[0041 ] 實施例4
[0042]將30頭懷孕80天的母豬（大白豬）隨機分成2組，第一組注射生理鹽水lmL，第二組 注射濃度為3mg/mL的質(zhì)粒lmL，注射部位為后肢肌肉。后經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，轉(zhuǎn)移電壓 為30V，脈沖頻率5Hz，脈沖脈寬90ms;于妊娠母豬產(chǎn)仔后檢測仔豬的體重，按800克為標準計 算弱仔數(shù)及弱仔率，結(jié)果第二組出生體重比第一組提高92克/頭仔豬(P〈0.05)，弱仔率降低 6·6%(Ρ〈0·05)。
[0043] 實施例5
[0044]將30頭懷孕60天的母豬（大白豬）隨機分成2組，第一組注射生理鹽水lmL，第二組 注射濃度為4mg/mL的質(zhì)粒lmL，注射部位為后肢肌肉。后經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，轉(zhuǎn)移電壓 為30V，脈沖頻率6Hz，脈沖脈寬80ms;于妊娠母豬產(chǎn)仔后檢測仔豬的體重，按800克為標準計 算弱仔數(shù)及弱仔率，結(jié)果第二組出生體重比第一組提高99克/頭仔豬(P〈0.05)，弱仔率降低 7·2%(Ρ〈0·05)。
[0045] 由實施例1-5可知，將pVAXl-GRF質(zhì)粒注射入孕豬肌肉中，經(jīng)基因轉(zhuǎn)移后，可以明顯 提高出生仔豬的體重，降低出生仔豬的弱仔率，詳細結(jié)果如表1所示。
[0046] 表1、各實施例中出生仔豬體重及弱仔率統(tǒng)計表
[0047]
[0048] 注:在計算弱仔率時，仔豬的總數(shù)和計算平均體重時仔豬的總數(shù)相同。
[0049] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保 護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。
【主權(quán)項】
1. GRF表達質(zhì)粒在制備降低仔豬出生弱仔率的藥物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述GRF表達質(zhì)粒為pVAXl-GRF質(zhì)粒。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述降低仔豬出生弱仔率的藥物為注射 劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于:所述降低仔豬出生弱仔率的藥物為肌肉注 射劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述降低仔豬出生弱仔率的藥物為孕豬注 射藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于:所述孕豬為懷孕60-80天的母豬。
【專利摘要】本發(fā)明涉及GRF表達質(zhì)粒在制備降低仔豬出生弱仔率的藥物中的用途。本發(fā)明通過向孕豬肌肉注射GRF表達質(zhì)粒，進行基因轉(zhuǎn)移，使GRF表達質(zhì)粒在母豬肌肉組織中高效表達，進而促進胎兒的發(fā)育，降低了出生仔豬的弱仔率，最終達到提高養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟效益的目的，具有巨大的實際應(yīng)用價值。
【IPC分類】A61K48/00, A61P15/00
【公開號】CN105617404
【申請?zhí)枴緾N201610058264
【發(fā)明人】張永亮, 習欠云, 史合群
【申請人】廣州市科虎生物技術(shù)研究開發(fā)中心
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年1月27日