mir-5010及其成熟miRNA在制備骨肉瘤診療制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的設(shè)及mir-5010及其成熟miRNA在制備骨肉瘤 診療制劑的應(yīng)用，更具體的設(shè)及has-mir-5010及其成熟miRNA在制備骨肉瘤轉(zhuǎn)移診療制劑 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨肉瘤(osteosarcoma，0SA)是源于間葉組織的惡性腫瘤，W能產(chǎn)生骨樣組織的梭 形基質(zhì)細(xì)胞為特質(zhì)，多發(fā)生在青少年，嚴(yán)重影響青壯年身屯、健康，社會(huì)危害極大。有資料顯 示，80-90%的患者確診前已經(jīng)發(fā)生了全身的微病灶轉(zhuǎn)移，目前，單一肺轉(zhuǎn)移大多進(jìn)行手術(shù) 切除，但是對(duì)于多發(fā)轉(zhuǎn)移灶仍沒(méi)有辦法，因此，骨肉瘤轉(zhuǎn)移成為當(dāng)前進(jìn)一步提高生存率的瓶 頸，研究掲示骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制是臨床中迫切需要解決的重大問(wèn)題。骨肉瘤的病因和轉(zhuǎn)移機(jī) 理尚不完全清楚，研究表明，某些癌基因、抑癌基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的異常表達(dá)及腫瘤細(xì)胞 分泌的某些因子和骨肉瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
[0003] MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾 結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成。miRNA通過(guò)特異性結(jié)合 祀基因來(lái)調(diào)控其表達(dá)，典型作用方式主要有兩種:通常情況下，復(fù)合物中的單鏈miRNA與祀 mRNA的3'UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)，阻斷祀基因的翻譯，從而調(diào)芐基因表達(dá)；另一種作用方式與 SiRNA類(lèi)似，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，Ago2蛋白通過(guò)切割mRNA直接導(dǎo)致其降解，實(shí)現(xiàn) 基因沉默。
[0004] 發(fā)明基于高通量測(cè)序方法，對(duì)5例轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者及5例原發(fā)性骨肉瘤患者對(duì)照 進(jìn)行測(cè)序，獲得其miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)而進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選取后備miRNA進(jìn)行分子生 物學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的miRNA與骨肉瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可用于臨床診斷及預(yù)防 檢測(cè)，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種防治骨肉瘤轉(zhuǎn)移試劑，所述試劑包含：
[0006] (a)抑制劑和/或抑制劑組合物，所述抑制劑和/或抑制劑組合物下調(diào)mir-5010和/ 或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷mir-5010和/或其成熟miRNA的活性；
[0007] (b)藥劑學(xué)上能接受的載體。
[000引 mir-5010的序列見(jiàn)序列表沈Q ID NO l，mir-5010的成熟miRNA為miR-5010-5p和 miR-5010-化序列見(jiàn)序列表沈Q ID NO 2和沈Q ID NO 3。
[0009] 優(yōu)選的，采用反義寡核巧酸、antagomiRs、miRNA海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點(diǎn)反義寡核巧酸的方法下調(diào)mir-SOlO和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或阻 斷mir-5010和/或其成熟miRNA的活性。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供mir-5010和/或其成熟miRNA在制備診斷和/或防治骨肉瘤 試劑中的應(yīng)用。
[0011] 優(yōu)選的，mir-5010的成熟miRNA為miR-5010-5p，miR-5010-5p在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組中 局表達(dá)。
[0012] 進(jìn)一步，診斷和/或防治骨肉瘤試劑為診斷和/或防治骨肉瘤轉(zhuǎn)移試劑。
[0013] 進(jìn)一步，mir-5010和/或其成熟miRNA在制備診斷和/或防治骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵 襲試劑中的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步，診斷骨肉瘤試劑包括基于高通量測(cè)序方法和/或基于定量PCR方法和/或 基于探針雜交方法檢測(cè)骨肉瘤樣本中mir-5010和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測(cè) 方法檢測(cè)骨肉瘤樣本中mir-SOlO調(diào)控的祀基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用nodhern雜交方法、 miRNA表達(dá)譜忍片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨肉 瘤樣本中mir-5010和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄;采用化ISA和/或膠體金試紙條檢測(cè)骨肉瘤樣 本中mir-SOlO調(diào)控的祀基因的表達(dá)情況。
[0015] 優(yōu)選的，基于定量PCR方法包括特異性擴(kuò)增mir-5010和/或其成熟miRNA的引物，進(jìn) 一步優(yōu)選，特異性擴(kuò)增mir-5010成熟miRNA的引物序列為SEQ ID N04;基于探針雜交方法包 括與mir-5010和/或其成熟miRNA的核酸序列雜交的探針;免疫檢測(cè)方法包括與mir-5010調(diào) 控基因表達(dá)蛋白特異性結(jié)合的抗體。
[0016] 進(jìn)一步，檢測(cè)骨肉瘤樣本為外周血。
[0017] 進(jìn)一步，防治骨肉瘤試劑包括下調(diào)mir-5010和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或抑制 mir-5010和/或其成熟miRNA的活性的試劑。
[0018] 優(yōu)選的，采用反義寡核巧酸、antagomiRs、miRNA海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點(diǎn)反義寡核巧酸的方法下調(diào)mir-SOlO和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或阻 斷mir-5010和/或其成熟miRNA的活性。
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨肉瘤診斷試劑，骨肉瘤診斷試劑能夠檢測(cè)骨肉瘤樣 本中mir-5010和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或免疫檢測(cè)方法檢測(cè)骨肉瘤樣本中mir-5010和/或 其成熟miRNA調(diào)控的祀基因的表達(dá)情況。
[0020] 進(jìn)一步，骨肉瘤診斷試劑基于高通量測(cè)序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于 探針雜交方法檢測(cè)骨肉瘤樣本中mir-5010和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或基于免疫方法檢測(cè) 骨肉瘤樣本中mir-5010和/或其成熟miRNA調(diào)控的祀基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用nodhern雜 交方法、miRNA表達(dá)譜忍片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù) 檢測(cè)骨肉瘤樣本中mir-5010和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄;采用化ISA和/或膠體金試紙條檢測(cè) 骨肉瘤樣本中mir-5010和/或其成熟miRNA調(diào)控的祀基因的表達(dá)情況。
[0021] 本發(fā)明的目的在于提供mir-5010的祀基因在制備診斷和/或防治骨肉瘤制劑中的 應(yīng)用。
[0022] 進(jìn)一步的，所述骨肉瘤為轉(zhuǎn)移性骨肉瘤。
[0023] 定義；
[0024] 現(xiàn)階段檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平的方法主要包括基于高通量測(cè)序技術(shù)、基于核巧酸 雜交和基于PCR的miRNA檢測(cè)方法?；谔结橂s交技術(shù)的miRNA檢測(cè)方法是一種直接檢測(cè)法， 不需要對(duì)樣本RNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，包括nodhern雜交方法、miRNA表達(dá)譜忍片、核酶保護(hù)分析技 術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。
[0025] (l)No;rthe;rn 雜交
[0026] 又稱(chēng)RNA印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測(cè)真核生物RNA大小，估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法?；?本原理如下：首先在載體(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA樣本，再與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的探針雜 交，洗涂多余的雜交探針后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)；也可W在載體上先固定與祀miRNA序列互補(bǔ)的 DNA探針，然后與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的樣本miRNA雜交，再進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。信號(hào)標(biāo)記的方法包括同位素 標(biāo)記、巧光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。
[0027] (2)miRNA表達(dá)譜忍片
[0028] 原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測(cè)固相支持物上的目標(biāo)分子。通過(guò)設(shè)計(jì)忍片上miRNA 基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平?；蛉唐哂懈咄康膬?yōu) 點(diǎn)，可W-次在同一樣本中檢測(cè)出幾百個(gè)基因的全部表達(dá)。Luminex公司研制的液相忍片 (Xiquid chip)又稱(chēng)多功能懸浮點(diǎn)陣(Multi anal}fte suspension array,MASA)，是出的新 一代生物忍片技術(shù)。液相忍片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不 同的探針?lè)肿?，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個(gè)獨(dú)特的 色彩編號(hào)，將運(yùn)些小球體懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了液相忍片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可W對(duì)同 一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同分子同時(shí)進(jìn)行快速的定性、定量分析，運(yùn)種檢測(cè)技術(shù)被稱(chēng)為 FMAP(Flexit)Ie multianalyte profiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測(cè)速度極 快。
[0029] (3)核酶保護(hù)分析技術(shù)(RPA)
[0030] miRNA的檢測(cè)還可W采用核酶保護(hù)分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測(cè)RNA樣本混 合，熱變性后雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受 保護(hù)的RNA分子，最后通過(guò)變性PAGE電泳分離探針，顯色。運(yùn)種基于液相雜交的新方法簡(jiǎn)單 快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
[0031] (4)RAKE法
[0032] RAKE法（RNAprimed array based Klenow emzyme)是在miRNAmicroarray的基礎(chǔ) 上利用DNA聚合酶I的K1 enow片段，使mi RNA與固定的DNA探針雜交的方法。RAKE可W敏感特 異地檢測(cè)miRNA,適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中檢 ^UmiRNA表達(dá)譜情況。不僅如此，RAKE法還可W從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分 離出miRNA并對(duì)其進(jìn)行分析，為從存檔標(biāo)本中分析miRNA開(kāi)啟了希望之口。