[0033] (5)原位雜交（in situ hybridization)
[0034] 原位雜交技術(shù)可直觀了解miRNA表達(dá)方式，是觀測(cè)miRNA時(shí)空表達(dá)的一種較簡(jiǎn)便的 方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、巧光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交化OCked Nucleic Aci(KLNA)based in situ hyb;ridization(LNA-I甜））是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針方 式。
[OO%] (6)基于微球的流式細(xì)胞術(shù)(bead-based flow c}ftomet;ry)
[0036] 是一種液相忍片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測(cè)與忍片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來，兼有 通量大、檢測(cè)速度快、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)。
[0037] (7)實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)(Realtime PCR，RT-PCR)
[0038] 巧光檢測(cè)PCR儀可對(duì)整個(gè)PCR過程中擴(kuò)增序列的累積速率繪制動(dòng)態(tài)變化曲線。在反 應(yīng)混合體系中祀序列的起始濃度越大，要求獲得擴(kuò)增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的PCR循環(huán)數(shù)(一般用 特定闊值循環(huán)數(shù)Ct來表達(dá))越少。由于miRNA長(zhǎng)度僅為22nt，傳統(tǒng)的qRT-PCR不適合擴(kuò)增如此 短的片段?，F(xiàn)今有幾種用于miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR方法，如加尾法、頸環(huán)法等。頸環(huán)法是一種 理想的miRNA檢測(cè)qRT-PCR方法:首先設(shè)計(jì)特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，W待測(cè)miRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄 合成cDNA第一鏈，該cDNA-端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開便增加了 cDNA的長(zhǎng)度，隨后 W合成的CDNA為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。qRT-PCR具有特異性高、靈敏度好、快 速簡(jiǎn)單等多種優(yōu)點(diǎn)。
[0039] (8)測(cè)序法
[0040] 大部分已知的miRNA都是通過CDNA克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建miRNA 的CDNA文庫(kù)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體上測(cè)序。化kada開發(fā)了一種改 進(jìn)的擴(kuò)增克隆法(miRNA amplification profiling,mRAP)，mRAP法先在miRNA的3'端連上 接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樘囟ǖ姆崔D(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核巧酸 轉(zhuǎn)移酶活性，一些核巧酸（主要是脫氧胞巧酸)會(huì)連接到反轉(zhuǎn)錄出的CDNA鏈的3'末端。當(dāng)5' 端接頭與CDNA鏈的POly(C)粘性末端退火后，加入一對(duì)共用引物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)CDNA的PCR擴(kuò) 增。由于mRAP高度靈敏，可W直接用克隆和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)少量組織中miRNA的表達(dá)量。標(biāo)簽 序列克隆法是一種在在基因表達(dá)系列分析（SAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測(cè)效率更高的 miRAGE(miRNASAGE)克隆法，該法通過生成大的串聯(lián)子，通過單個(gè)測(cè)序反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè) miRNA，明顯提高了檢測(cè)效率。
[0041 ] 高通量測(cè)序（High-throughput sequencing)又稱下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定，極大提高了測(cè)序效率。運(yùn)類大規(guī)模測(cè)序技術(shù)極大的提高了多個(gè)物種遺 傳信息的解讀速度，為獲取所有miRNA的序列信息，解密miRNA圖譜提供了保證。同時(shí)高通量 測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所W又被稱為深度 測(cè)序(deep sequencing)。高通量測(cè)序平臺(tái)的代表是羅氏公司（Roche)的454測(cè)序儀(Roch GSFLX sequencer) ,Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer)和 ABI的SOLiD測(cè)序儀(ABI SOLiD sequencer)。
[0042] 免疫檢測(cè)方法是W-種抗體或多種抗體作為分析試劑，對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量或定性 分析的檢測(cè)方法。其基本原理是抗體和抗原之間的相互作用。為提高抗原和抗體檢測(cè)的敏 感性，將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)，通過檢測(cè)標(biāo)記物，反映有無抗原抗體反應(yīng)， 從而間接測(cè)出微量的抗原或抗體。常用的標(biāo)記物有酶、巧光素、放射性同位素、膠體金及電 子致密物質(zhì)等。運(yùn)種抗原或抗體標(biāo)記上顯示物所進(jìn)行的特異性反應(yīng)稱為免疫標(biāo)記技術(shù) Qmmunolabelling technique)。目前應(yīng)用最廣的免疫檢測(cè)技術(shù)主要有:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，膠體金免疫層析法等。
[0043] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理是將抗原或抗體與底物(酶)結(jié)合，使其保持免疫反應(yīng)和酶 的活性。把標(biāo)記的抗原或抗體與包被于固相載體上的配體結(jié)合，再使之與相應(yīng)的無色底物 作用而顯示顏色，根據(jù)顯色深淺程度目測(cè)或用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值判定結(jié)果。
[0044] 膠體金試紙條一般由樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水墊四部分組成。層析材料有硝 化纖維膜(NC)、聚醋膜、尼龍膜和PVDF膜等，根據(jù)試驗(yàn)需要可選擇不同要求的膜，其中NC膜 最為常用，使用前可根據(jù)試驗(yàn)具體情況確定是否需要活化或處理，多數(shù)情況下無需處理，即 可直接使用。將金標(biāo)蛋白溶液均勻噴涂在金標(biāo)墊上，于室溫下驚干備用。NC膜可捕獲一定量 的包被(抗體)和二抗作為檢測(cè)線和質(zhì)控線。最后將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙依次固定 于PVC板，即成試紙條。
[0045] 基于RNA的microRNA功能獲得性技術(shù)即通過外源性補(bǔ)充miRNAs合成的前體物質(zhì)來 升高miRNAs的水平。例如，可W人工合成與內(nèi)源性miRNA序列一致的短發(fā)夾樣RNA(shod hairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或HI做啟動(dòng)子，W病毒為載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被Dicer酶修飾 后載入RISC發(fā)揮作用，相當(dāng)于升高pre-miRNA的水平，作用效果穩(wěn)定而持久。
[0046] 基因特異性miR Mimics技術(shù)該技術(shù)避免了miRNA與基因的非特異性作用。運(yùn)種人 工合成的與祀基因3'UTR互補(bǔ)結(jié)合的特異性寡核巧酸鏈，能夠起到與miRNA相同的轉(zhuǎn)錄后調(diào) 節(jié)作用。
[0047] 包含在本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上許可的載體為在制劑時(shí)通常利用的載 體，該載體包含乳糖（lactose)、右旋糖（dextrose)、薦糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘 露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡膠、憐酸巧、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、娃酸巧、 微晶纖維素、聚乙締化咯燒酬(9〇17￥；[]171971'1'〇11(1〇]1日）、纖維素(。日11111〇3日）、水、糖漿、甲 基纖維素(methyl cellulose)、徑基苯甲酸甲醋(methyl hyhowbenzoate)、丙基徑基苯 甲酸丙醋（propyl hyhowbenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearic acid magnesium)及礦物 油(mineral oil)等，但并非局限于此。
[004引本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分W外還可W包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜味劑、香 味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細(xì)記載于雷明登氏 藥學(xué)全書。
[0049] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能通過口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時(shí)，能通 過靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮 給藥等方式進(jìn)行給藥。
[0050] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可W 進(jìn)行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對(duì)所希望的治療或預(yù)防有效的給 藥劑量。
[0051] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W容易實(shí)施 的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來進(jìn)行制劑化，從而能夠W單位用量形態(tài) 制備或者內(nèi)裝在多容量容器內(nèi)來制備。此時(shí)，劑型是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或 乳化液形態(tài)，或者也可W是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態(tài)，還可W包括分散 劑或者穩(wěn)定劑。
【附圖說明】
[0化2] 圖1是RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中miR-5010-5p相對(duì)表達(dá)水平圖
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 W對(duì)運(yùn)些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0054] 實(shí)施例1樣品的收集及總RNA提取
[0055] 5例轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者及5例原發(fā)骨肉瘤患者對(duì)照。所有患者要求空腹至少12h，于 次日清晨7:00~8:00室溫下，抽取IOml靜脈血于乙二胺四乙酸化DTA)抗凝管，提取外周血 單個(gè)核細(xì)胞PBMCs，加入1ml hizol試劑（Invitrogen公司），充分混勻，-80°C保存標(biāo)本，W 用于RNA提取。所有的血樣和病理結(jié)果應(yīng)真實(shí)可靠，研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。 [0化 6] RNA提取標(biāo)準(zhǔn)：RNA純度：0D260/280 含 1.8，28S/18S 含 1; RNA完整性：RIN值含 7.0。 RNA完整性檢測(cè)方法:Agilent 2100(RNA6000化no kit)、瓊脂糖凝膠電泳(