葉酸受體靶向的5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及葉酸受體革El向的5 -氟尿啼啶/葉酸脂質(zhì)體藥物 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為代表的氟尿嘧啶類(lèi)藥物在臨床上應(yīng)用了40多年，對(duì)消化道 癌及其它實(shí)體腫瘤有較好療效[1]。541!-般通過(guò)靜脈注射給藥，但5-Fu經(jīng)靜脈注入血液后 半衰期短，且有較嚴(yán)重的骨髓抑制及胃腸反應(yīng)的毒副作用 [2]。因此，對(duì)5-Fu進(jìn)行修飾改性及 用脂質(zhì)體包封緩釋釋放等方面的研究也較多。
[0003] 脂質(zhì)體作為一種非病毒載納米載體材料具有適合體內(nèi)降解、毒性低和無(wú)免疫原 性、提高藥物生物利用度、降低藥物毒副作用等優(yōu)點(diǎn) [34]。其作為藥物載體已有30多年的歷 史，脂質(zhì)體作為給藥載體可以有效的實(shí)現(xiàn)藥物的靶向，提高藥物的局部保存濃度，延長(zhǎng)藥物 作用時(shí)間，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷力，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用等。
[0004] 目前，抗腫瘤藥物的靶向細(xì)胞遞送受到廣泛關(guān)注，大量研究結(jié)果表明，多數(shù)腫瘤細(xì) 胞表面上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細(xì)胞 [5<]，并且葉酸(folic acicUFA)對(duì) 葉酸受體具有高度親和性，因此可將抗腫瘤藥物與FA偶聯(lián)，經(jīng)葉酸受體介導(dǎo)靶向遞送到這 些腫瘤細(xì)胞中。而且FA作為靶向分子具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如相對(duì)分子質(zhì)量小、無(wú)免疫原 性、價(jià)廉易得、穩(wěn)定性好、與藥物分子或載體之間的化學(xué)鍵合簡(jiǎn)單易行，靶向應(yīng)用范圍廣泛 等⑴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種葉酸受體靶向的5-氟尿嘧 啶/葉酸脂質(zhì)體藥物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的復(fù)合脂質(zhì)體藥物毒性低，轉(zhuǎn)染率高，能 有效克服腫瘤細(xì)胞的耐受性。
[0006] 發(fā)明構(gòu)思是:本發(fā)明以氨基甲酸酯型陽(yáng)離子類(lèi)脂為主要材料制備脂質(zhì)體，采用薄 膜分散超聲方法實(shí)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)5-氟尿嘧啶的有效包封，經(jīng)過(guò)葉酸靶向修飾制備成靶 向脂質(zhì)體藥物，最終得到5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體與葉酸的納米尺寸的新型復(fù)合藥物制劑。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物， 其組成包括藥物脂質(zhì)體和葉酸，其中藥物脂質(zhì)體包括5-氟尿嘧啶、陽(yáng)離子類(lèi)脂和膽固醇，陽(yáng) 離子類(lèi)脂與5-氟尿嘧啶的質(zhì)量比為5:1~20:1;藥物脂質(zhì)體和葉酸的質(zhì)量比為10:1~40:1。
[0008] 優(yōu)選的，所述的陽(yáng)離子類(lèi)脂與藥物脂質(zhì)體的質(zhì)量比為10:1~20:1，更優(yōu)選的，陽(yáng)離 子類(lèi)脂與5-氟尿嘧啶的質(zhì)量比為10:1。
[0009]優(yōu)選的，所述的藥物脂質(zhì)體和葉酸的質(zhì)量比為20:1。
[0010] 所述陽(yáng)離子類(lèi)脂為氨基甲酸酯型陽(yáng)離子類(lèi)脂。
[0011] 進(jìn)一步的，所述氨基甲酸酯型陽(yáng)離子類(lèi)脂具有通式I的結(jié)構(gòu)：
[0012]
[0013]其中，R1S(CH2)11CH 3;
[0014] R2 為 CH3 XH2CH3;
[0015] X 為 Cl、Br、I〇
[0016] 優(yōu)選的，所述氨基甲酸酯型陽(yáng)離子類(lèi)脂為:Ν-[1-(2,3-含氧十二烷基氨基甲酰)丙 基]-N，N，N-三甲基色氨酸銨碘化物。
[0017] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是請(qǐng)求保護(hù)上述5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物的制備方法， 具體包括如下步驟：
[0018] ①5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體的制備:將陽(yáng)離子類(lèi)脂和膽固醇溶解在有機(jī)溶劑中，超聲充 分溶解，用氮?dú)獯的?，真空干燥過(guò)夜;按陽(yáng)離子類(lèi)脂與5-氟尿嘧啶的質(zhì)量比為5:1~20:1稱(chēng) 取5-氟尿嘧啶，溶于磷酸鹽緩沖液，加入到附有干燥薄膜的管內(nèi)，常壓水浴，得脂質(zhì)體混懸 液;將脂質(zhì)體混懸液反復(fù)超聲震蕩至澄清，制得5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體；陽(yáng)離子類(lèi)脂和膽固醇可 以按照摩爾比1:1~6:1的比例制得，優(yōu)選方式下陽(yáng)離子類(lèi)脂和膽固醇的摩爾比3:1。
[0019] ②5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物的制備:將步驟①得到的5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體與葉 酸按質(zhì)量比10:1~40:1混合，室溫超聲混勻，孵育，制得5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物。
[0020] 優(yōu)選的，步驟①所述的水浴條件為:45~55°C水浴1.5~2h;步驟②所述孵育條件 為：45~55°C孵育15~20min。
[0021 ]優(yōu)選的，所述的磷酸鹽緩沖液pH值為7.4。
[0022]本發(fā)明第三個(gè)目的是請(qǐng)求保護(hù)上述5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物在抗癌、抗腫瘤 藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明提供一種新的能同時(shí)裝載藥物和復(fù)合葉酸的復(fù)合靶向脂質(zhì)體，本發(fā)明的復(fù) 合脂質(zhì)體采用新型陽(yáng)離子類(lèi)脂，極好的降低了構(gòu)建脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。在制備5-氟尿嘧啶 脂質(zhì)體時(shí)通過(guò)優(yōu)化陽(yáng)離子類(lèi)脂與膽固醇的配比，減小了 5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體的粒徑。再經(jīng)過(guò) 葉酸對(duì)5_氟尿嘧啶脂質(zhì)體的靶向修飾后，還可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。
[0024] 本發(fā)明的5-氟尿嘧啶/葉酸復(fù)合脂質(zhì)體具有對(duì)藥物的高包封率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本 發(fā)明的復(fù)合脂質(zhì)體對(duì)5-氟尿嘧啶包封率均大于70%。另外本發(fā)明的5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì) 體的粒徑范圍100-250nm，有利于通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，有效提高藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，是現(xiàn) 有技術(shù)未能達(dá)到的效果。本發(fā)明的5-氟尿嘧啶/葉酸復(fù)合脂質(zhì)體藥物的制備方法簡(jiǎn)單、高 效，制備出的復(fù)合脂質(zhì)體毒性低、轉(zhuǎn)染率高，在物理學(xué)表征和體外生物學(xué)研究中均已得到了 良好的評(píng)價(jià)效果，安全高效、靶向性強(qiáng)、可用于聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)，為抗癌藥物的研究開(kāi)發(fā)提供了新 的途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為5-氟尿嘧啶/葉酸復(fù)合脂質(zhì)體粒徑檢測(cè)圖；
[0026] 圖2為5-氟尿啼啶/葉酸復(fù)合脂質(zhì)體物zeta電位檢測(cè)圖；
[0027] 圖3為5-氟尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品、5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體共有最大吸收波長(zhǎng)掃 描圖；
[0028] 圖4為標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0029]圖5為紫外分光光度計(jì)-透析法測(cè)定DDCTMA-5-Fu 10/1最大吸收波長(zhǎng)處吸光值(A) 掃描圖，其中I為DDCTM空白脂質(zhì)體掃描曲線；II為DDCTM-5-Fu 10/1掃描曲線；
[0030] 圖6為T(mén)EM檢測(cè)分析圖，其中A為DDCTMA脂質(zhì)體TEM檢測(cè)分析圖；B為DDCTMA-5-FU 10/1TEM檢測(cè)分析圖；C為lOFA-DDCDMA-5-Fu 10/1TEM檢測(cè)分析圖；
[0031] 圖7為5-氟尿嘧啶/葉酸復(fù)合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)程中對(duì)葉酸受體(FR)陽(yáng)性表達(dá)率較高 的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(H460)細(xì)胞毒性的測(cè)定結(jié)果；
[0032] 圖8為流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，但不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，如無(wú)特 殊說(shuō)明，本發(fā)明所涉及化學(xué)試劑及藥品均市售可得，如無(wú)特殊說(shuō)明，所涉及的方法均為常規(guī) 方法。
[0034] -、制備5-Fu脂質(zhì)體
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 稱(chēng)量一定質(zhì)量的新型陽(yáng)離子類(lèi)脂DDCTMA，DDCTMA與膽固醇摩爾比3/1溶于ImL三氯 甲烷中，室溫超聲5min~IOmin使其充分溶解，氮?dú)獯的?，真空干燥過(guò)夜。按DDCTMA與5-Fu質(zhì) 量比為5:1稱(chēng)取5-Fu，溶于pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，加入到附有干燥薄膜的管內(nèi)，常壓下 45~55°C水浴1.5~2h，制得脂質(zhì)體混懸液。55°C反復(fù)超聲震蕩至澄清，制得5-Fu脂質(zhì)體 (DDCTMA-5-Fu5/l)〇 [0037] 實(shí)施例2
[0038] 稱(chēng)量一定質(zhì)量的新型陽(yáng)離子類(lèi)脂DDCTMA，DDCTMA與膽固醇摩爾比3/1溶于ImL三氯 甲烷中，室溫超聲5~IOmin使其充分溶解，氮?dú)獯的?，真空干燥過(guò)夜。按DDCTMA與5-Fu質(zhì)量 比為10:1稱(chēng)取5-Fu，溶于pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，加入到附有干燥薄膜的管內(nèi)，常壓下 45~55°C水浴1.5~2h，制得脂質(zhì)體混懸液。55°C反復(fù)超聲震蕩至澄清，制得5-Fu脂質(zhì)體 (DDCTMA-5-FulO/l)〇 [0039] 實(shí)施例3
[0040] 稱(chēng)量一定質(zhì)量的新型陽(yáng)離子類(lèi)脂DDCTMA，DDCTMA與膽固醇摩爾比3/1溶于ImL三氯 甲烷中，室溫超聲5~IOmin使其充分溶解，氮?dú)獯的?，真空干燥過(guò)夜。按DDCTMA與5-Fu質(zhì)量 比為15:1稱(chēng)取5-Fu，溶于pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，加入到附有干燥薄膜的管內(nèi)，常壓下 45~55°C水浴1.5~2h，制得脂質(zhì)體混懸液。55°C反復(fù)超聲震蕩至澄清，制得5-Fu脂質(zhì)體 (DDCTMA-5-Fu 15/1)〇 [0041 ] 實(shí)施例4
[0042] 稱(chēng)量一定質(zhì)量的新型陽(yáng)離子類(lèi)脂DDCTMA，DDCTMA與膽固醇摩爾比3/1溶于ImL三氯 甲烷中，室溫超聲5min~IOmin使其充分溶解，氮?dú)獯的?，真空干燥過(guò)夜。按DDCTMA與5-Fu質(zhì) 量比為20:1稱(chēng)取5-Fu，溶于pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，加入到附有干燥薄膜的管內(nèi)，常壓 下45~55°C水浴1.5~2h，制得脂質(zhì)體混懸液。55°C反復(fù)超聲震蕩至澄清，制得5-Fu脂質(zhì)體 (DDCTMA-5-Fu20/l)〇
[0043] 二、5-Fu脂質(zhì)體包封率的測(cè)定
[0044] 實(shí)施例5
[0045] ①測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
[0046] 以超純水作為參比，用紫外分光光度計(jì)分別對(duì)5-Fu標(biāo)準(zhǔn)液（IOOyg · ml/1)、5-Fu檢 測(cè)液（l〇〇yg · ml/1)和空白對(duì)照液（IOOyg · ml/1)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，并確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。從圖 3可以看出5-Fu標(biāo)準(zhǔn)品和5-Fu脂質(zhì)體在265nm處有共有最大吸收波長(zhǎng)，而空白脂質(zhì)體對(duì)照液 在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收較小，可忽略其對(duì)5-Fu的最大吸收波長(zhǎng)的影響，故選擇的測(cè)定波長(zhǎng)為 265nm〇
[0047] ②標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0048] 配制濃度分別為2yg · InIZ1Jyg · IiiIZ1Jyg · mL-1Jyg · mL-1、IOyg · mL-1、12yg · mL'14yg · mL'16yg · ml/1的5-Fu標(biāo)準(zhǔn)液。用紫外分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)處以超純水 為參比測(cè)定各溶液的吸光值(A)，并作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為C = 16.957A+ 0.2183(R2 = 0.9996)〇
[0049] ③測(cè)定5-Fu脂質(zhì)體中藥物含量
[0050] 選擇空白脂質(zhì)體透析外液為參比，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè) 定游離藥物溶液的吸光值(A)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其濃度，再根據(jù)公式包封率=(1 一游 離藥物的量/脂質(zhì)體混懸液中藥物的總量）X 100%算出脂質(zhì)體的包封率。實(shí)驗(yàn)測(cè)得在265nm 波長(zhǎng)處，5-Fu脂質(zhì)體的吸光值為0.057，計(jì)算得到5-Fu脂質(zhì)體包封率為70.38%。
[00511三、5-氟尿嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物的制備
[0052] 實(shí)施例6
[0053]將實(shí)施例2制備的DDCTM-5-Fu 10/1脂質(zhì)體進(jìn)一步修飾得到靶向復(fù)合載體5-氟尿 嘧啶/葉酸脂質(zhì)體藥物，具體方法為:所述復(fù)合載體中總脂質(zhì)與葉酸(FA)按質(zhì)量比為10:1~ 40:1混合，漩渦震蕩混勻，在55 °C孵育20min，即得葉酸靶向復(fù)合物(FA-DDCDMA-5-Fu 10/ 1)〇
[0054] 實(shí)施例7復(fù)合物粒徑和Zeta電位檢測(cè)
[0055]采用激光散射粒度儀(H0RIBA納米粒度儀SZ-100)在25°C，光散射角度90度條件下