測定所制復合物的粒徑及Zeta電位。用移液槍取20yL實施例6制備的葉酸靶向復合物(FA-DDCDM-5-Fu 10/1)稀釋于ImL超純水中分別進行粒徑和Zeta電位檢測，結果見圖1和圖2。 [0056]圖1的結果顯示，不同的復合物粒徑范圍在100-250nm，在轉染的有效粒徑（〈Ιμπι) 范圍之內(nèi)。圖2的結果顯示，F(xiàn)A-DDCTMA-5-Fu帶負電荷，且電位隨著加入葉酸量的增多呈現(xiàn) 出減小趨勢，考慮到復合物與質粒的靜電作用，加入葉酸的濃度不宜過高。
[0057]實施例8復合物形態(tài)檢測
[0058]①滴樣：用鑷子夾取銅網(wǎng)，用移液槍取制備好的樣品各8yL，分別滴加一滴樣品于 銅網(wǎng)上，靜置25-30min。
[0059] ②染色：用吸水紙或濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體，用移液槍滴加 SyL 2%的磷 媽酸負染液，染色時間30s，然后用吸水紙吸去染色液。
[0060] ③檢測：用透射電子顯微鏡(TEM)檢測樣品形態(tài)。
[0061 ]實施例9體外細胞實驗 [0062] ①毒性檢測(MTT比色法）
[0063] 將H460細胞種植于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔種植約1.5 X IO5個細胞，RPMI1640培 養(yǎng)液總體積IOOyL將細胞放置在37°C，5%C02孵育16~24h，細胞密度約80~90%。移去生長 培養(yǎng)基，用等量（IOOyL)RPMI 1640(無血清)培養(yǎng)基清洗，再用50yL RPMI 1640(無血清)培養(yǎng) 基替換。
[0064]將實施例2制備的5-Fu脂質體和實施例6制備的葉酸靶向復合物稀釋液50yL分別 加入96孔細胞培養(yǎng)板孔中，輕輕搖勻，并設有空白細胞對照，以及空白脂質體和5-Fu溶液作 為對照組，置于37 °C，5%CO2孵育24h，每孔細胞中加入20yL MTT(Sigma，5mg/mL)，37°C，5 % CO2孵育培養(yǎng)4h。小心棄去所有培養(yǎng)液，晾干，加入150yL二甲基亞砜(DMSO)，將96孔細胞培 養(yǎng)板放入SUNRI SE酶標儀中設置震蕩I Omin，使結晶物溶解，然后繼續(xù)在SUNRI SE酶標儀中測 定各孔在570nm處的吸光值，讀出原始數(shù)據(jù)。
[0065]基于MTT比色法的檢測原理為:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還 原為水不溶性的藍紫色結晶甲攢(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，二甲基 亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲攢，用酶標儀在570nm波長處測定其吸光值，可間接反映活細 胞數(shù)量。故此，以空白對照(未轉染細胞）的吸光值為100 %，計算轉染后細胞存活的百分率 (%)。計算公式為：
[0066] 細胞存活率（％ ) = [A]?a/[A]對照 X 100%
[0067] [A]?a為測試孔的吸光值，為陰性空白對照孔的吸光值。
[0068]實驗結果如圖7所示，結果表明，空白脂質體對細胞存活率影響較小，在80 % -95 % 之間，證明了脂質體是一種安全、可靠的載體。DDCTMA-5-Fu脂質體作用于H460細胞時，隨濃 度的增加細胞存活率下降，在相同濃度下，DDCTM-5-Fu脂質體作用下的細胞存活率高于5-Fu單獨作用下的細胞存活率，說明將5-Fu制備成脂質體藥物后，能有效降低其對細胞產(chǎn)生 的毒性。而DDCTMA-5-Fu脂質體復合葉酸后，癌細胞存活率降低，說明復合葉酸能夠有效提 高DDCTMA-5-Fu脂質體對癌細胞的靶向性，增強藥物療效，具有實際意義。②流式細胞儀檢 測細胞凋亡
[0069] 將H460細胞種植于6孔細胞培養(yǎng)板中，RPMI1640培養(yǎng)液總體積2000yL將細胞放置 在37 °C，5 %C02培養(yǎng)16~24h，細胞密度達到80~90 %時移去生長培養(yǎng)基，用1000 yL RPMI1640(無血清)培養(yǎng)基清洗一次。按實施例2制備的5-Fu脂質體和實施例6制備的葉酸靶 向復合物，用RPMI1640(無血清)分別稀釋至600yL，并加入6孔細胞培養(yǎng)板孔中，輕輕搖勻， 并設有空白細胞對照，以及空白脂質體和5-Fu溶液作為對照組，并保證復合載體、空白脂質 體、5-Fu脂質體和5-Fu溶液的濃度一致，均為0.08mg/mL，于37°C，5%CO 2孵育24h。
[0070]在完成細胞轉染后，1000 rpm離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并 計數(shù)。取5-10萬重懸的細胞，1000 rpm離心5分鐘，棄上清，加入195yLAnnexin V-FITC結合液 輕輕重懸細胞。加入5yLAnnexin V-FITC，輕輕混勻。加入IOyL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。 室溫(20-25Γ)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。隨即進行流式細胞儀檢測。結果如圖 8所示。結果顯示，所制備的FA-DDCTMA-5-Fu復合物誘導細胞凋亡能力較DDCTMA-5-Fu脂質 體有所提高，說明經(jīng)過葉酸修飾后增加了藥物對癌細胞的靶向性，可為癌癥或腫瘤的治療 提供依據(jù)，具有實際意義。
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【主權項】
1. 一種5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物，其組成包括藥物脂質體和葉酸，其中藥物脂質體 包括5-氣尿喀晚、陽離子類脂和膽固醇，陽離子類脂與5-氣尿喀晚的質量比為5:1~20:1; 藥物脂質體和葉酸的質量比為10:1~40:1。2. 根據(jù)權利要求1所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物，其特征在于，所述的陽離子類 脂與5-氣尿喀晚的質量比為10:1~20:1。3. 根據(jù)權利要求1所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物，其特征在于，所述的藥物脂質 體和葉酸的質量比為20:1。4. 根據(jù)權利要求1所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物，其特征在于，所述陽離子類脂 為氨基甲酸醋型陽離子類脂。5. 根據(jù)權利要求1所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物，其特征在于，所述氨基甲酸醋 型陽離子類脂具有通式I的結構：其中，虹為（C出）iiC出； 化為C出、C出C出； X 為 C1、化、I。6. 根據(jù)權利要求5所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物，其特征在于，所述氨基甲酸醋 型陽離子類脂為:N-[l-(2,3-含氧十二烷基氨基甲酯)丙基]-Ν，Ν，Ν-Ξ甲基色氨酸錠艦化 物。7. -種如權利要求1所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物的制備方法，其特征在于，具 體包括如下步驟： ① 5-氣尿喀晚脂質體的制備:將陽離子類脂和膽固醇按照摩爾比1:1~6:1溶解在有機 溶劑中，超聲充分溶解，用氮氣吹膜，真空干燥過夜;按陽離子類脂與5-氣尿喀晚的質量比 為5:1~20:1稱取5-氣尿喀晚，溶于憐酸鹽緩沖液，加入到附有干燥薄膜的管內(nèi)，常壓水浴， 得脂質體混懸液;將脂質體混懸液反復超聲震蕩至澄清，制得5-氣尿喀晚脂質體； ② 5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物的制備:將步驟①得到的5-氣尿喀晚脂質體與葉酸按 質量比10:1~40:1混合，室溫超聲混勻，解育，制得5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物。8. 根據(jù)權利要求7所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物的制備方法，其特征在于，步驟 ①所述的水浴條件為:45~55°C水浴1.5~化;步驟②所述解育條件為:45~55°C解育15~ 20min。9. 根據(jù)權利要求7所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物的制備方法，其特征在于，步驟 ①所述的憐酸鹽緩沖液pH值為7.4。10. -種如權利要求1所述的5-氣尿喀晚/葉酸脂質體藥物在抗癌、抗腫瘤藥物中的應 用。
【專利摘要】本發(fā)明涉藥物制劑領域，具體涉及葉酸受體靶向的5-氟尿嘧啶/葉酸脂質體藥物及其制備方法和應用。5-氟尿嘧啶/葉酸脂質體藥物組成包括藥物脂質體和葉酸，其中藥物脂質體包括5-氟尿嘧啶、陽離子類脂和膽固醇，陽離子類脂與5-氟尿嘧啶的質量比為5:1～20:1；藥物脂質體和葉酸的質量比為10:1～40:1。本發(fā)明的5-氟尿嘧啶/葉酸復合脂質體具有對藥物的高包封率，脂質體的粒徑范圍在100～250nm，有效提高藥物的轉運效率。本發(fā)明的5-氟尿嘧啶/葉酸復合脂質體藥物的制備方法簡單、高效，制備出的復合脂質體毒性低、轉染率高，在物理學表征和體外生物學研究中均已得到了良好的評價效果，安全高效、靶向性強、可用于聯(lián)合轉運，為抗癌藥物的研究開發(fā)提供了新的途徑。
【IPC分類】A61K47/48, A61K9/127, A61K31/513, A61P35/00
【公開號】CN105687137
【申請?zhí)枴緾N201610079566
【發(fā)明人】崔韶暉, 張樹彪, 孟垚, 支德福, 趙軼男
【申請人】大連民族大學
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年2月4日