FAB)質(zhì)譜分析來實施。
[0044] 本發(fā)明優(yōu)選的化合物由氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:l)或所述氨 基酸序列的7個或更多個氨基酸的部分組成，或包括1-5個氨基酸改變的所述氨基酸序列或 其所述部分的變體，其中所述化合物結(jié)合MAP激酶ρ38α。進一步的優(yōu)選與上面一樣。如下所 討論，優(yōu)選地本發(fā)明的化合物是N -乙酰化的，特別優(yōu)選地，由氨基酸序列 HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No: 1)組成的化合物是N-乙?；?。當所有氨基酸是L-氨基 酸且所有氨基酸殘基之間有肽鍵時，由氨基酸序列HKSRALLIFQIQMWLRRQ(SEQ ID No: 1)組 成并且是N-乙?；幕衔锏木幪柺荁B2702。
[0045] 本發(fā)明的化合物可包括至少一個D-氨基酸殘基，例如1個或2個或3個或4個或5個 或6個或7個或8個D-氨基酸。通常，本發(fā)明的化合物包含0個、1個、2個或3個D-氨基酸。本發(fā) 明的化合物中D-氨基酸的存在可用于防止蛋白酶引起的化合物的降解。使肽對蛋白質(zhì)降解 有抵抗力的其他方法包括封閉N-和/或C-端氨基酸殘基。因此，在一些實施方案中，使N-和/ 或C-端氨基酸殘基封閉。合適的封閉方法包括N-端乙?；蛟贜-端合并焦谷氨酸殘基 (pyroglutamate residue)。
[0046] 有許多不同的方法來設計和合成不含有酰胺鍵的肽化合物。在例如以引用的方式 并入本文的Sherman&Spatola( 1990) J. Am. Chem. Soc. 112,433所公開的一種方法中，一個或 多個酰胺鍵由各種化學官能團以基本上同配的方式（isoteric manner)替換。
[0047] Retro-inverso模擬肽，其中肽鍵是反向的，可通過本領域已知的方法合成，例如M 6zigre et al(1997) J. Immunol .1593230-3237中描述的方法，其以引用的方式并入本文。 該方法涉及使偽肽（pseudopeptide s)包括涉及骨架而不是側(cè)鏈方向的改變。Retro-inverso 肽包括 NH-CO 鍵而不是 CO-NH 肽鍵， 其更能抗蛋白 水解。
[0048] 將環(huán)部分（cyclic moiety)引入到肽基框架（peptide-based framework)中可能 是有利的。該環(huán)部分限制了肽結(jié)構的構象空間，這可導致肽對MAP激酶ρ38α的親和力增強。 該策略的附加優(yōu)勢是，將環(huán)部分引入肽中可能還導致肽對細胞肽酶（ce Ilular peptidases)的選擇性降低。
[0049] 雖然優(yōu)選本發(fā)明的化合物是所定義的肽，但在本發(fā)明的一些實施方案中，該化合 物由連接另一部分的肽組成?？蛇B接肽的方便部分包括聚乙二醇(PEG)和肽序列，例如增強 向細胞遞送的TAT和觸角足(antennapedia)。
[0050] 聚乙二醇化是本領域技術人員熟知的方法，其中修飾(肽或其他化合物）以使一個 或多個聚乙二醇(PEG)分子與一個或多個氨基酸的側(cè)鏈共價連接。其是最重要的分子變構 化學技術(MASC)之一?？墒褂闷渌鸐ASC技術，這樣的技術可提高化合物的藥效性質(zhì)，例如延 長其在體內(nèi)的血清半衰期。通過首先激活PEG部分以使其與本發(fā)明的化合物反應并結(jié)合來 形成PEG-肽綴合物。PEG部分在分子量和構象上變化很大，其中早期（early)部分（單官能 PEG，mPEG)是分子量為12kDa或更小的直線型，后期（later)部分的分子量增加。PEG2,最近 創(chuàng)新的PEG技術涉及30kDa(或更小）的mPEG結(jié)合至賴氨酸氨基酸(盡管聚乙二醇化可擴展為 將PEG添加至其他氨基酸），經(jīng)過進一步反應形成表現(xiàn)得像更大分子量的直線型mPEG的支鏈 結(jié)構（Kozlowski et al·，（2001) ,Biodrugs 15,419-429) aRoberts et al(2002)Adv Drug Deliv Rev 54,459-476,Bhadra et al.,(2002)Pharmazie 57,5-29,Kozlowski et al., (2001)J Control Release 72,217-224和Veronese(2001)Biomaterials 22,405-417進一 步描述了可用于使PEG分子共價連接至本發(fā)明的化合物的方法，其以引用的方式并入本文。 [0051]本發(fā)明化合物的聚乙二醇化的潛在優(yōu)勢包括降低腎清除率，對一些產(chǎn)品來說，這 導致了皮下施用后更持續(xù)的吸收以及限制性分布，可能導致更恒定和持續(xù)的血漿濃度，并 因此增加臨床療效。其他潛在優(yōu)勢包括降低治療化合物的免疫原性，以及較低的毒性。 [0052]本發(fā)明的化合物是一種能夠結(jié)合MAP激酶ρ38α的化合物。MAP激酶ρ38α是氨基酸序 列（SEQ ID No: 18)如圖1所示的人體酶。方便地，該酶可與多肽序列例如GST融合，這可使其 固定在固體底物上。
[0053]當本發(fā)明的化合物是肽時，測定與MAP激酶ρ38α結(jié)合的適宜方式是使用噬菌體展 示技術。編碼先導肽（peptide leads)的DNA可以克隆至Ml3gpIII·菌粒載體，轉(zhuǎn)化至 E.coli TGl細胞，并置于2%葡萄糖、2xTY、100μg/ml氨芐青霉素(ampicillin)的板上。生長 出菌落用于生產(chǎn)所述的卩策菌體顆粒(3(：〇1^&3111；[1:11(1990)3(^61106 249,386-390)。對于試 驗，在室溫下將Iyg的MAP激酶ρ38α涂覆于在100μ1 PBS中的MaxiSorp?聚苯乙烯板(Nunc? brand，F(xiàn)isher Scientif ic，Loughborough，U · K ·)上 1 小時，然后用PBS清洗一次，隨后在室 溫下用含2%BSA的PBS封閉1小時。每個孔中加入100μΙ的噬菌體上清液，并在室溫下培養(yǎng)1 小時。將板用PBS/Tween20清洗四次，用PBS清洗兩次。辣根過氧化物酶綴合的(horseradish peroxidase_conjugated)(HRP)抗-M13第二抗體（GE Healthcare U.K.Ltd. ,Chalfont St .Giles，U.K.)以1:5000在含2%BSA的PBS中稀釋，并在室溫下培養(yǎng)一小時，然后進行上述 的清洗。進行McGregor & Robins(2001)Anal .Biochem.294,108-117所述的ELISA試驗。用 SureBlue TMB過氧化物酶底物（Insight Biotechnology(洞察生物技術），Middlesex, U.K.)進行試驗，并在450nm下讀取。用與如上所述相同的ELISA條件，檢測結(jié)合MAP激酶ρ38α 的肽對生物素化MAP激酶ρ38α和鏈霉親合素（streptavidin)的特異性，然后檢測對鏈霉親 合素涂覆板（StreptaWell;Roche Diagnostics Ltd. ,Burgess Hill,U.K·)中所有以0.5yg 涂覆的半乳糖苷酶、BclX、抗-FLAG M2抗體、卵清蛋白和溶解酵素的特異性。該方法可用 于建立結(jié)合MAP激酶ρ38α的直接特異性肽，通過對照背景上增加的色度信號（color imeric signal)來表示結(jié)合。
[0054]特別優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物是一種競爭性結(jié)合MAP激酶ρ38α的具有SEQ ID No: 1的肽(都是L-氨基酸，且氨基酸殘基之間包括肽鍵，所述肽是N-乙酰化的，即ΒΒ2702)的 化合物。如下可測定化合物是否是一種競爭結(jié)合MAP激酶ρ38α的具有SEQ ID No: 1的肽的化 合物。
[0055] 熒光標記（即用熒光團）N-乙酰化的肽HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQIDNo:l)(即 BB2702)，并使其結(jié)合MAP激酶ρ38α。該肽被化合物替換(replacement)指示為該化合物結(jié)合 MAP激酶ρ38α，并可通過焚光偏振(fluorescence polarization)測量。焚光偏振是實證的 焚光檢測技術，使用平面偏振激發(fā)(plane polarized excitation)測量產(chǎn)生的焚光發(fā)射的 垂直和水平分量。任何熒光標記復合體的偏振值（以mP單位測量)與所述復合體的分子轉(zhuǎn)動 速度負相關。由于分子轉(zhuǎn)動進而與其分子體積負相關，因此當熒光標記肽與任何足夠大以 減緩其分子轉(zhuǎn)動速率的分子(該情況中是MAP激酶ρ38α)相互作用時，熒光標記肽會具有較 高的偏振值。因此，偏振信號的振幅用于定量測定熒光標記肽結(jié)合的范圍，而不需要任何過 濾或清洗分離步驟。使用焚光偏振檢測方法的替換結(jié)合試驗（displacement binding assay)的原理是熒光標記肽和未標記化合物之間對結(jié)合MAP激酶ρ38α對接位點的競爭。與 未標記化合物的結(jié)合引起熒光標記肽替換和mP信號損失。任何信號損失均指示替換。與少 量的信號損失指示較少的替換相比，大量的信號損失指示更多的替換。任何數(shù)量的熒光偏 振讀寫器均可用于測量替換。
[0056]更進一步優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物是一種抑制MAP激酶ρ38α的化合物。如下可測 定MAP激酶ρ38α的抑制。髓鞘堿性蛋白（MBP)是MAP激酶ρ38α的底物，并在該酶和ATP的存在 下磷酸化。磷酸化事件可使用能識別磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸殘基的抗體監(jiān)控，或通過測 量放射性標記的磷酸鹽合并到蛋白質(zhì)中來監(jiān)控。通過MBP磷酸化的降低來測量抑制。ΒΒ2702 直接抑制MAP激酶ρ38α，并抑制MAP激酶ρ38α的激活。這可以通過考慮到ΒΒ2702對磷酸化和 未磷酸化的MAP激酶ρ38α的活性看出（參見下面實施例9中的表3)。本發(fā)明的化合物可通過 ΜΚΚ6抑制MAP激酶ρ38α的激活。
[0057 ]特別優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物是一種結(jié)合并抑制MAP激酶ρ38α、但基本上不結(jié)合 和抑制 Jnnk、PKCd、p38b、AMPK、AurA、GK3b、RAFl、JNK3、VEGF、p38g、PKCb、PKCa、PDHK2、PDKl、 MKK6、p27KIP、Cdk2KIP、Prak KIP、ChklKIP、Egfr KIP、Kdr KIP、EGF KIP、Zap 70KIP、IGFR KIP、Src KIP、Fak KIP、Jak3KIP、Akt CIRA和Mek CCEK中任何一個的化合物。使用標準方法 并利用商業(yè)服務來測定化合物是否抑制這些和其它蛋白激酶。例如，可使用Merck Millipore's Kinase Profiler?及其第54版的服務試驗協(xié)議（Service Assay protocol)。
[0058]優(yōu)選地，對于所列出的、本發(fā)明的化合物基本上不結(jié)合的如果不是所有酶但至少 是一種酶，本發(fā)明的化合物的IC5O值> ΙμΜ，更優(yōu)選>5μΜ或> 10μΜ。
[0059]優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物對人類MAP激酶ρ38α的I C5Q〈 ΙμΜ。如使用下面的方法所 測量的，更優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物的IC5Q〈0. ΙμΜ，優(yōu)選〈0.05μΜ，更優(yōu)選〈0.01μΜ，進一步 優(yōu)選〈Ο.ΟΟΙμΜ。通過使用增加濃度的化合物測試固定濃度的MAP激酶ρ38α的抑制程度來計 算IC 5Q。當以y軸為抑制程度、X軸為肽濃度在對數(shù)量表(log scale)上繪制時，通常會提供從 〇或最低濃度處的〇 %抑制直至最高劑量處的100 %抑制的S形曲線。達到50 %抑制的點被稱 為抑制濃度50或IC5Q，用于在酶的固定濃度處建立化合物的效力。
[0060]如實施例8中更詳細的討論，化合物HKSRALLIFQIQMWLRRQ(SEQ ID N〇:1)(BB2702) 的IC5q為0.007μΜ，并顯示對MAP激酶ρ38α有非常高的選擇性。不受任何理論束縛，本發(fā)明人 認為該高選擇性部分是由于化合物與不存在于其他蛋白激酶中的MAP激酶ρ38α上的位點結(jié) 合，而不與ATP結(jié)合口袋(binding pocket)結(jié)合。認為該位點在人類MAP激酶ρ38α和犬MAP激 酶ρ38α之間是保守的。ATP結(jié)合口袋是在所有蛋白激酶和其他許多ATP結(jié)合蛋白中發(fā)現(xiàn)的保 守的ATP結(jié)合口袋，所以可存在于人類(或犬類)蛋白質(zhì)組的數(shù)以百計的蛋白質(zhì)中。由于在許 多不同的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了 口袋，并由于其負責ATP的結(jié)合，因此，產(chǎn)生阻斷ATP結(jié)合蛋白質(zhì)從 而防止酶活性的選擇性抑制化合物是非常具有挑戰(zhàn)性的。另一方面，活性位點之外的位點 的多樣性更大，且經(jīng)常只與單一靶蛋白相關。因此，MAP激酶ρ38α上活性位點之外的位點可 能是人類(或犬類）蛋白質(zhì)組中這種性質(zhì)的唯一位點，與其他這樣的位點沒有明顯的同源 性，因此提供了化合物與其結(jié)合的非常高的選擇性的機會。因此，通過在不尋常的、可能是 唯一的結(jié)合口袋處結(jié)合化合物來抑制MAP激酶ρ38α，提供了選擇性抑制MAP激酶 Ρ38α的更大 可能性，并因此避免了偏離目標的副作用和毒性。
[0061 ]本發(fā)明的第三個方面提供抑制MAP激酶ρ38α的方法，該方法包括將所述激酶與本 發(fā)明的化合物接觸。通常，該方法在體外實施。因此，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物用作分析MAP激酶 ρ38α的試劑。本發(fā)明還包括用于分析MAP激酶ρ38α的部分的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的 化合物和MAP激酶ρ38α的底物。MAP激酶ρ38α的合適底物包括髓鞘堿性蛋白（MBP)、ΜΚ2/ ΜΑΡΚΑΡΚ2、MNK-1、PRAK和MSKl JBP是優(yōu)選的底物。因此，本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物用于 抑制MAP激酶ρ38α的用途。
[0062]已知MAP激酶ρ38α的抑制是治療上有用的，特別是用于治療炎性病癥。因此，本發(fā) 明的第四個方面提供本發(fā)明的化合物在治療個體的醫(yī)學中的用途。所述個體可以是人類或 非人類動物，例如非人類