時競爭分析）.Anal .Biochem. 221，142-151)， 用Biacore 3000檢測結(jié)合相互作用。將已知結(jié)合激酶嘌呤位點的靶定義化合物(脲基喹唑 啉(11^丨(1〇911；[1^201；[116)化合物，圖5)固定在傳感器芯片上。將1^?激酶口38€[與各種濃度的 檢測化合物孵育30分鐘，然后使其流過傳感器。未結(jié)合的ρ38α與給出信號的靶定義化合物 相關(guān)，這可能與游離濃度相關(guān)。分析劑量-響應(yīng)數(shù)據(jù)以估算Kd值(例如1或3,其中KZ=Kd),因 為由靶定義化合物引起的競爭沒有引起中點的明顯移動。在pH 8.5下以5yL/min的速率進 行7分鐘注射(注射11.5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺與75mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙 基）碳二亞胺鹽酸鹽的混合物，然后是在IOmM HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、3.4mM EDTA、 0.005%(v/v)表面活性劑P20、4%(v/v)二甲基亞砜中的400μΜ化合物，最后是ImM乙醇胺）， 將靶定義化合物通過氨基偶聯(lián)固定到研究級CM-5芯片上。固定水平通常為約3000個共振單 元(resonance units)。在沒有祀定義化合物的情況下制備參照流通池。所有測量使用的流 速為20yL/min并且做減法以消除折光率變化和注射噪音（injection noise)。通過注射5yL IOOmM NaOH實現(xiàn)表面再生。當響應(yīng)隨著時間線性增加時，使用60秒的報告點（report point)用非磷酸化或磷酸化的ρ38α校準芯片。響應(yīng)是線性的，直到至少400nM蛋白。Kd測量 在10-50ηΜ ρ38α下進行，并且被確認為是25nM。該結(jié)合親和力與生物化學上推導的為7nM的 Ki是不相違的。
[0186] 圖4示出了BIA核心分析的結(jié)果。
[0187] 實施例8:BB2702對MAP激酶ρ38α結(jié)合的NMR研究
[0188] 用于抑制由ΜΚΚ6引起的MAP激酶ρ38α激活的BB2702(IC5Q=lnM)與由TOKl引起的底 物激酶激活(substrate kinase activation)涉及的PRK2衍生的疏水PDKl-相互作用片段 或'PIF'-口袋結(jié)合基序共享序列基序（LIFQKI)(Balendran et al(1999)Curr.Biol.9, 393-402)。在PDKl的晶體結(jié)構(gòu)中（Biondi et al(2002)EMB0 J.21(16),4219-28)，對稱相關(guān) 的TOKl分子的CtG螺旋占據(jù)了催化結(jié)構(gòu)域N-端葉片（lobe) "后"側(cè)上的疏水基序結(jié)合口袋，模 仿與底物激酶的分子間相互作用。然而，MAP激酶ρ38α缺乏等同的疏水基序結(jié)合口袋:MAP激 酶ρ38αΝ_端葉片的該區(qū)域被其本身的C-端螺旋代替占據(jù)，因此通過等效相互作用介導該 ΒΒ2702肽有效結(jié)合MAP激酶ρ38α似乎是不可能的。
[0189] 另一方面，來自MEF2A轉(zhuǎn)錄因子和MAP激酶ρ38α的其他底物的肽的晶體結(jié)構(gòu)，以及 最近的MAP激酶ρ38α和ΜΚ2之間的復合體的晶體結(jié)構(gòu)顯示，MAP激酶ρ38α具有形成于C-端葉 片上的底物對接槽，鄰近ATP結(jié)合位點（Chang et al(2002)Mol.Cell.9(6)，1241-9;ter Haar et al(2007)J.Biol.Chem.282(13) ,9733-9)。發(fā)明人推斷，盡管與已知的MAP激酶p38 α底物激酶對接基序缺少明顯的序列相似性，但該對接槽可能是BB2702和MAP激酶ρ38α之間 相互作用的一個可能位點。為了研究該位點，發(fā)明人使用NMP來監(jiān)控由結(jié)合ΒΒ2702和MEF2A 肽誘導的MAP激酶ρ38α光譜的骨架酰胺化學位移擾動(CSP) 3Β2702肽的亞化學劑量濃度誘 導匪R時間量表的慢交換限制中的化學位移變化，與高親和力（<1μΜ)結(jié)合一致，如預期的， 在1:1化學計量下，所述位移基本上是飽和的（數(shù)據(jù)未顯示KMEF2A肽的結(jié)合顯示了與由 ΒΒ2702肽誘導的那些相似模式的CSP:許多相同共振態(tài)的激酶受到影響，表明兩種肽可能共 享相似的或重疊的結(jié)合位點。此外，與MEF2A肽結(jié)合激酶對接槽相似，CSP與小分子ATP競爭 的ρ38抑制劑明顯不同（Sullivan et al(2005)Biochemistry 44(50) ,16475-90)。然而，與 BB2702肽相反，MEF2A肽的結(jié)合弱得多，從NMR滴定數(shù)據(jù)的預計Kd是250μΜ。為了進一步探討 MEF2A肽和ΒΒ2702肽結(jié)合位點之間的關(guān)系，然后發(fā)明人將ΒΒ2702肽加入到具有MEF2A肽前結(jié) 合(pre-bound)的MAP激酶ρ38α樣品中。ΒΒ2702(240μΜ)完全能替換MEF2A肽（5mM)，總結(jié)為 BB2702肽單獨結(jié)合的CSP模式（圖5B)。相反，與其較弱親和力一致，當添加順序相反時，根據(jù) 未改變的CSP判斷，MEF2A肽（ImM)不能替換BB2702肽（150μΜ)(數(shù)據(jù)未顯示）?？傊琋MR數(shù)據(jù) 支持了假設(shè)，即ΒΒ2702肽可結(jié)合或接近于用于與上游激酶調(diào)節(jié)劑對接的ρ38α上的槽。
[0190] 實驗細節(jié)
[0191] 將BB 2702滴定至均勻的15\2!1-標記的6財8-]\^?激酶？38€[的樣品（12(^]\〇中 (Sullivan et al(2005)Biochemistry 44(50) ,16475-90)，或者其自身，或者添加 MEF2A轉(zhuǎn) 錄因子衍射肽（Chang et al(2002)Mol. Cell .9(6) ,1241-9) (RKPDLRVVIPPSS)。每次添加后 獲得咕-14了肋5￥-批00匪1?波譜。如51111"3116七31(2005)所述，2981(下，在配置有!〇^三 重共振冷凍探針的600MHz Varian Inova光譜儀上記錄NMR實驗。
[0192] 實施例9:BB2702的選擇性
[0193] 下表1比較了 2種選擇的肽的活性和其抑制磷酸化并因此抑制MKK6或MKK3下激活 ρ38α的能力。其也顯示了抑制激活的ρ38α能力的編碼肽磷酸化許多底物的能力。表中的數(shù) 據(jù)顯示，ΒΒ2702抑制由ΜΚΚ6而不是ΜΚΚ3引起的磷酸化，此外，直接抑制任何有活性的ρ38α以 防止MBP或ΜΚ2的磷酸化。因此，ΒΒ2702通過抑制ρ38α的激活和通過鈍化有活性的 Ρ38α起作 用。
[0194] 表2和表3(下面）：ΒΒ2702抑制其他蛋白激酶的能力通過在ΙΟμΜ的肽下對超過30種 蛋白激酶測試來評價。這是選擇性板。在抑制劑結(jié)合ATP結(jié)合口袋的地方，可以預期超過這 個數(shù)目的激酶缺少選擇性。然而，ΒΒ2702對高達10μΜ的大多數(shù)激酶靶是不活躍的，實際上僅 在6種激酶中看到了輕微活性，但當與ρ38α相比時，該6種激酶具有總共500-1000倍選擇性。 最活躍的脫靶效應(yīng)是針對MPK激酶家族的高度同源的家族成員ρ38β。然而，即使在這里，選 擇性超過100倍?？傊?，我們可以得出結(jié)論，即ΒΒ2702對ρ38α抑制是非常有選擇性的。
[0196] 實施例10:LPS刺激的THP-I細胞中由BB2702引起的TNFa產(chǎn)量的抑制
[0197] 圖6表明，當THP-I細胞以劑量依賴的方式用BB2702處理、然后用LPS(脂多糖)刺激 時，已知為ρ38α下游的炎性細胞因子TNFa的產(chǎn)量明顯下降。這表明，在公認的THP-I細胞炎 癥模型中，ΒΒ2702可抑制由ρ38α介導的炎性信號。
[0198]在用LPS(10yg/mL)刺激之前，用不同劑量的BB2702(lnM、ΙΟηΜ、lOOnM、1000 nM)預 培養(yǎng)THP-I細胞5小時。用ELISA測定細胞上清液中的TNF-a，一式兩份。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)為5個實 驗的平均值，每個實驗重復操作兩次。每個的標準偏差落入平均值的15%內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種化合物，其包括氨基酸序列HKSRALLIFQIαMWLRRQ(SEQIDNo:l)或包括所述氨 基酸序列的7個或更多個氨基酸的部分，或包括1-5個氨基酸改變的所述氨基酸序列或其所 述部分的變體，其中所述化合物結(jié)合MAP激酶ρ38α。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，與SEQ ID No: 1的位置相比，位置4是R，位置9是 F，位置10是Q。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，與SEQ ID No: 1的位置相比，位置2是K、R或 H，位置8是I、L或M，位置13是M、I或L，和/或位置16是R、H或K。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中，與SEQ ID N〇:l的位置相比，是K，位置8是I，位 置13是Μ或位置16是R。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中，與SEQ ID No: 1的位置相比，位置2是Κ，位置8是 I，位置13是Μ和位置16是R。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其分子量小于25000道爾頓。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其由所述氨基酸序列 HKSRALLIFQKMWLRRQ(SEQ ID Νο:1)或者所述氨基酸序列的7個或更多個氨基酸的部分組 成，或包括1-5個氨基酸改變的所述氨基酸序列或其所述部分的變體，其中所述化合物結(jié)合 MAP 激酶 ρ38α。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其由所述氨基酸序列 HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID Νο:1)組成。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的化合物，其選自以下氨基酸序列： HKSRALLIFQKIMWLRR(SEQ ID No:2), HKSRALLIFQKIMWLR(SEQ ID No:3), HKSRALLIFQKIMWL(SEQ ID No:4), HKSRALLIFQKIMff(SEQ ID No:5)， KSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:6), SRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:7), SRALLIFQKIM(SEQ ID No:8), SRALLIFQ(SEQ ID No:9), HALAIFQKIMff(SEQ ID No:10)， HKSRALAIFQKIMALRRQ(SEQ ID No:11), AKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:12), HKSRAALIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:13), HKSRALLIFQKIMWARRQ(SEQ ID No:14), HKSRALLIFQKIMWLRAQ(SEQ ID No:15), HKSRALLIFQKIMWLRRA(SEQIDNo:16)S SRALLIFQKI(SEQ ID No:17)。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其在氨基酸之間包含至少一個非肽鍵。11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其包含至少一個D-氨基酸殘基。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中所述N-和/或C-端殘基是封閉的。13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中所述化合物是結(jié)合至另一部分的 肽。14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其基本上抗蛋白酶消化。15. -種組合物，其包括權(quán)利要求1-14中任一項所述的化合物和一種或多種其他治療 化合物，例如抗炎化合物，抗感染化合物例如抗真菌化合物或抗增殖化合物。16. 權(quán)利要求1-14中任一項所述的化合物或權(quán)利要求15所述的組合物，用于醫(yī)學。17. -種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-14中任一項所述的化合物或權(quán)利要求15所述 的組合物，以及藥學上可接受的賦形劑或載體。18. -種抑制MAP激酶ρ38α的方法，所述方法包括使所述激酶與權(quán)利要求1-14中任一項 所述的化合物或權(quán)利要求15所述的組合物接觸。19. 權(quán)利要求1 -14中任一項所述的化合物或權(quán)利要求15所述的組合物在抑制MAP激酶 ρ38α中的用途。20. -種治療個體炎性病癥的方法，所述方法包括向個體施用權(quán)利要求1-14中任一項 所述的化合物或權(quán)利要求15所述的組合物。21. 權(quán)利要求1-14中任一項所述的化合物或權(quán)利要求15所述的組合物，用于治療個體 炎性病癥。22. 權(quán)利要求1-14中任一項所述的化合物或權(quán)利要求15所述的組合物在制備用于治療 個體炎性病癥的藥物中的用途。23. -種鑒定結(jié)合MAP激酶ρ38α的分子的方法，所述方法包括確定所述分子是否在權(quán)利 要求1-14中任一項所述的化合物結(jié)合MAP激酶ρ38α的位置處結(jié)合MAP激酶ρ38α。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其進一步包括將鑒定的分子配制為藥學上可接受的 組合物的步驟。25. -種制備藥物組合物的方法，其包括執(zhí)行權(quán)利要求23所述的方法，以及將鑒定的分 子與藥學上可接受的載體混合的步驟。26. 如本文所公開的結(jié)合MAP激酶ρ38α的任何新肽。27. 如本文所公開的結(jié)合MAP激酶ρ38α的任何新肽，用于治療個體炎性病癥。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種化合物，其包括氨基酸序列HKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:1)或包括所述氨基酸序列的7個或更多個氨基酸的部分，或包括1-5個氨基酸改變的所述氨基酸序列或其所述部分的變體，其中所述化合物結(jié)合MAP激酶p38α。該化合物用于結(jié)合和抑制MAP激酶p38α，并作為研究工具用于藥物發(fā)現(xiàn)、醫(yī)學，特別是用于治療炎性病癥。
【IPC分類】C07K9/00, A61K38/10
【公開號】CN105705158
【申請?zhí)枴緾N201480045406
【發(fā)明人】約翰·瑞登
【申請人】藍莓療法有限公司
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2014年8月15日
【公告號】EP3033094A1, US20160193281, WO2015022549A1