一種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的植物藥研究思路一般為繁瑣的提取分離，最終需要從提取的復(fù)合成分中分離出具有活性的單一成分。然而植物藥的相關(guān)有效成分往往含量較低，分離步驟繁瑣，采用傳統(tǒng)的提取方法效率很低，會(huì)無(wú)法滿足后期的研究生產(chǎn)需要。當(dāng)今分子生物技術(shù)已日趨成熟，利用基因工程實(shí)現(xiàn)某一目的產(chǎn)物的異源生產(chǎn)已經(jīng)成為了新的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著提取分離技術(shù)的發(fā)展，人們從苦瓜中分離到多種具有降血糖、抗突變、抗腫瘤以及提高人體免疫力等功效的核糖體失活蛋白，其中在這些苦瓜蛋白成分中，分子量為30kD的I型核糖體失活蛋白MAP30(Momordica ant1-HIV protein of 30kD)的各項(xiàng)性能優(yōu)越，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗真菌作用，對(duì)人體健康十分有益，可制成一種保健藥品。但作為一種蛋白，制成普通的制劑會(huì)在胃中被消化破壞，而通過(guò)從苦瓜中利用傳統(tǒng)方法提取MAP30污染大，效率低，故準(zhǔn)備先利用基因工程技術(shù)通過(guò)工程菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)活性苦瓜蛋白MAP30，最終制成一種富含活性蛋白MAP30的苦瓜蛋白腸溶片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝，采用基因工程生產(chǎn)高純度苦瓜蛋白MAP30，制成極具保健功能的苦瓜蛋白腸溶片；苦瓜蛋白腸溶片不僅避免了傳統(tǒng)苦瓜片口感差、易在胃中分解的問(wèn)題，更減少了傳統(tǒng)苦瓜蛋白MAP30提取帶來(lái)的污染，且這種苦瓜片中有效蛋白MAP30的含量高，更能促進(jìn)人體的健康。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0005]—種苦瓜蛋白腸溶片的制備工藝，包括以下步驟:
[0006]步驟一:苦瓜原料的處理:取適量的成熟苦瓜中的種子，除去種子殼，然后放入研缽中，加入適量的液氮研磨成粉末狀，分裝得到處理后苦瓜種子粉；
[0007]步驟二:苦瓜種子粉的處理:將步驟一中分裝后的苦瓜種子粉，利用CTAB法提取得到苦瓜全基因組，作為PCR反應(yīng)的模板；
[0008]步驟三:PCR反應(yīng)的確定:首先根據(jù)相關(guān)苦瓜蛋白MAP30的基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)的引物，并最終確定PCR的條件及體系；
[0009]步驟四:TA克隆:PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行TA克隆，并導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽(yáng)性菌落，提取目標(biāo)DNA片段后進(jìn)行雙酶切；
[0010]步驟五:表達(dá)載體的處理:過(guò)夜培養(yǎng)PET-28a，提取表達(dá)質(zhì)粒，并用與步驟四相同的兩種酶進(jìn)行酶切；
[0011]步驟六:連接:將用步驟四與步驟五中相同酶切的片段在SOI ut i on I的體系中進(jìn)行過(guò)夜連接；
[0012]步驟七:將步驟六中的過(guò)夜連接的產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽(yáng)性菌落；
[0013]步驟八:將步驟七中篩選出的陽(yáng)性菌落放大培養(yǎng)并在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行苦瓜蛋白MAP30的表達(dá)；
[0014]步驟九:發(fā)酵培養(yǎng)后經(jīng)一系列處理將步驟八得到的的苦瓜蛋白MAP30進(jìn)行純化干燥；
[0015]步驟十:制腸溶片:首先將步驟九中確定發(fā)酵得到的苦瓜蛋白MAP30與輔料的比例，最后經(jīng)粉碎、過(guò)篩、配料、混合、濕法制粒、顆粒干燥、壓片、包腸溶衣、包裝、儲(chǔ)存。
[0016]所述步驟一中苦瓜粉分裝為:每管中分裝的具體量為10-15g。
[0017]所述步驟二中CTAB法的具體過(guò)程為:將水浴鍋溫控鈕調(diào)至60°C，預(yù)熱CTAB提取緩沖液—研磨得到的苦瓜粉末轉(zhuǎn)移至1mL預(yù)熱CTAB提取緩沖液中，60°C下不時(shí)晃動(dòng)離心管，保溫lh—冷卻片刻，加入1mL氯仿/異戊醇(24:1)，劇烈震蕩離心管，10000r/min離心15min—上清液轉(zhuǎn)入裝有25mL 100%乙醇的新離心管，輕柔地顛倒混勾—lOOOOr/min離心15min，棄上清，得到DNA沉淀—加700μ1 70%乙醇，70μ1 3mol/L NaAc溶液以漂洗DNA沉淀，然后轉(zhuǎn)至1.5mL Eppendorf—lOOOOr/min離心30s—再用70%乙醇漂洗DNA沉淀，離心30s，棄上清液—室溫下?lián)]發(fā)乙醇—加入500μ1 TE，4°C過(guò)夜溶解DNA—加4-10μ1 RNase Α，顛倒混勻，并在55°C下保溫30-60min—加入1.25mL乙醇、54μ1 NaAc，沉淀DNA—離心30s，室溫下?lián)]發(fā)乙醇—DNA沉淀溶解在300μ1 TE中。
[0018]所述步驟三中引物設(shè)計(jì)為
[0019]F157-CGTCGACCTGTGGTATGCTTACTACTT-37F2
[0020]57 -GGAATTCTCAATTCACAACAGATTCC-37，引入的酶切位點(diǎn)為SalI和EcoRI。
[0021]所述步驟三中PCR的體系和條件具體分別為:PCR20μ1體系為:ddH20 7μ1、引物各lyl、DNA模板lyl、2XTaq PCR Master Mix 10μ1 ;PCR反應(yīng)條件為:95°C5min、(95°C30s，58°C30s，722min)35cycle;72°C7min，4°C ⑴。
[0022]所述步驟四中的雙酶切體系條件為:質(zhì)粒DNA 25μ1，SalI和EcoRI分別Ιμ? ,Buffer5μ1，CldH2O 5μ1，混勻，37°Clh。
[0023]所述步驟五中的表達(dá)質(zhì)粒雙酶切體系條件為:質(zhì)粒DNA 25口1，5&1:^陽(yáng)(301?1分別仏
I,Buffer 5μl,ddH20 5μ1，混勻，37°Clh。
[0024]所述步驟六中經(jīng)相同酶處理后進(jìn)行連接的10μ1體系具體為:S0luti0nI5yl，目標(biāo)DNA 3μ1，表達(dá)質(zhì)粒2yl，16°C過(guò)夜連接。
[0025]所述步驟八中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的具體條件為:IPTG濃度為0.65mol/L，誘導(dǎo)溫度27°C，誘導(dǎo)時(shí)間4h。
[0026]所述步驟九中蛋白MAP30純化步驟具體為:在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)完畢后，收集菌體，然后用無(wú)菌水清洗3次，80Hz頻率下進(jìn)行超聲破碎，待到細(xì)菌全部破碎，溶液變清亮為止，然后在12000r/min離心15min，收集上清液，然后再利用鎳離子柱子手動(dòng)純化蛋白，上樣后先用50mmol/L PBS(pH7.4)，以60mL/min流速洗滌雜蛋白至基線，然后再分別用50、100和200mmol/L咪唑洗脫，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，接著收集得到純凈重組蛋白，冷凍干燥后4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0027]所述步驟十中因考慮到苦瓜蛋白MAP30在胃中易分解的性質(zhì)，最終制得的片劑包腸溶衣，保證了苦瓜片的效果。
[0028]所述步驟十中制腸溶片的具體工藝步驟為:稱取大規(guī)模發(fā)酵得到的純凈苦瓜蛋白MAP3060g，與6g淀粉混勻，加10 %的淀粉漿作粘合劑攪拌制成軟材，接著用14目尼龍篩制粒，將濕顆粒置于干燥器中40-60°C通風(fēng)干燥，過(guò)14目尼龍篩整粒，稱干顆粒重量，加入顆粒量5%的滑石粉混勻，接著用壓片機(jī)壓片得到片芯;最后包腸溶衣。
[0029]所述步驟十中包腸溶衣的具體工藝步驟為:先將Π號(hào)丙烯酸樹脂和95%乙醇按1:14重比例溶解制成5%樹脂溶液，再將鄰苯二甲酸二乙酯、聚山梨酯-80、蓖麻油按10:7:15的重量比混勻，研磨后加入5% Π號(hào)丙烯酸樹脂溶液中，過(guò)120目篩得到備用樹脂包衣液，將苦瓜蛋白MAP30片芯置包衣鍋中，按一般包衣方法包粉衣六層后，噴入上述樹脂包衣液，鍋溫控制在35 °C左右，4小時(shí)內(nèi)噴完。
[0030]所述步驟十中包腸溶衣處方為:Π號(hào)丙烯酸樹脂2.5kg、蓖麻油0.75kg、95%的乙醇