CR反應(yīng)條件:95°C5min、(95°C30s，58°C30s，722min)35cycle;72°C7min，4°C⑴，進(jìn)行體外擴(kuò)增得到目標(biāo)MAP30的特異性片段；
[0051 ]弓I 物設(shè)計(jì)為F15' - CGTCGACCTGTGGTATGCTTACTACTT-3/F25/ -GGAATTCTCAATTCACAACAGATTCC-37，引入的酶切位點(diǎn)為Sail和EcoRI ；
[0052]步驟四:TA克隆:PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行TA克隆，并導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽(yáng)性菌落，提取目標(biāo)DNA片段后進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系條件具體為:質(zhì)粒DNA 25yl，SalI和EcoRI分別Ιμ? ,Buffer 5yl，ddH20 5μ1，混勻，37°C Ih;
[0053]步驟五:表達(dá)載體的處理:過(guò)夜培養(yǎng)PET_28a菌株，后用試劑盒提取質(zhì)粒，并用與步驟四相同的兩種酶進(jìn)行酶切，表達(dá)質(zhì)粒雙酶切體系條件為:質(zhì)粒DNA 25yl，SalI和EcoRI分別Ιμ? ,Buffer 5μ1，ddH205yl，混勻，37°C Ih ；
[0054]步驟六:連接:經(jīng)步驟四與步驟五中相同酶處理后進(jìn)行連接，連接的ΙΟμΙ體系具體為:Solut1nI5yl，目標(biāo)DNA 3μ1，表達(dá)質(zhì)粒2ul，16°C過(guò)夜;
[0055]步驟七:將過(guò)夜連接的產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽(yáng)性菌落；
[0056]步驟八:接著將陽(yáng)性菌落放大培養(yǎng)并在27°C條件下利用0.65mol/L的IPTG誘導(dǎo)苦瓜蛋白MAP30表達(dá)4h;
[0057]步驟九:在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)完畢后，收集菌體，然后用無(wú)菌水清洗3次，80Hz頻率下進(jìn)行超聲破碎，待到細(xì)菌全部破碎，溶液變清亮為止，然后在12000r/min離心15min，收集上清液，然后再利用鎳離子柱子手動(dòng)純化蛋白，上樣后先用50mmol/L PBS(pH7.4)，以60mL/min流速洗滌雜蛋白至基線，然后再分別用50、100和200mmol/L咪唑洗脫，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，接著收集得到純凈重組蛋白，冷凍干燥后4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0058]步驟十:制腸溶片:先稱(chēng)取大規(guī)模發(fā)酵得到的純凈苦瓜蛋白MAP3060g，與6g淀粉混勻，加10 %的淀粉漿作粘合劑攪拌制成軟材，接著用14目尼龍篩制粒，將濕顆粒置于干燥器中50°C通風(fēng)干燥，過(guò)14目尼龍篩整粒，稱(chēng)干顆粒重量，加入顆粒量5%的滑石粉混勻，接著用壓片機(jī)壓片得到片芯，然后利用包腸溶衣處方制包衣液:Π號(hào)丙烯酸樹(shù)脂2.5kg、蓖麻油
0.75kg、95%的乙醇35kg、鄰苯二甲酸二乙酯0.5kg、聚山梨酯-80 0.35kg，先將Π號(hào)丙稀酸樹(shù)脂和95%乙醇按1:14重比例溶解制成5%樹(shù)脂溶液，再將鄰苯二甲酸二乙酯、聚山梨酯-80、蓖麻油按10: 7:15的重量比混勻，研磨后加入5% Π號(hào)丙烯酸樹(shù)脂溶液中，過(guò)120目篩最終得到備用樹(shù)脂包衣液，然后將苦瓜蛋白MAP30片芯置包衣鍋中，按一般包衣方法包粉衣六層后，噴入上述樹(shù)脂包衣液，鍋溫控制在35 °C左右，4小時(shí)內(nèi)噴完得到富含MAP30的腸溶苦瓜片，接著包裝、儲(chǔ)存，得到最終的苦瓜蛋白腸溶片。
[0059]實(shí)施例3
[0060]步驟一:苦瓜原料的處理:取150g的成熟苦瓜中的種子，除去種子殼，然后放入研缽中，加入適量的液氮研磨成粉末狀，按15g的量分裝處理后的苦瓜種子粉；
[0061 ]步驟二:苦瓜種子粉的處理:將分裝后的15g苦瓜種子粉，分別利用CTAB法提取得到苦瓜全基因組，CTAB法的具體過(guò)程為:將水浴鍋溫控鈕調(diào)至60°C，預(yù)熱CTAB提取緩沖液—研磨得到的苦瓜粉末轉(zhuǎn)移至1mL預(yù)熱CTAB提取緩沖液中，60°C下不時(shí)晃動(dòng)離心管，保溫Ih—冷卻片刻，加入1mL氯仿/異戊醇(24:1)，劇烈震蕩離心管，10000r/min離心15min—上清轉(zhuǎn)入裝有25mL 100%乙醇的新離心管，輕柔地顛倒混勾—lOOOOr/min離心15min，棄上清，得到DNA沉淀—加700μ1 70%乙醇，70μ1 3mol/L NaAc溶液以漂洗DNA沉淀，然后轉(zhuǎn)至1.5mLEppendorf—lOOOOr/min離心30s—再用70%乙醇漂洗DNA沉淀，離心30s，棄上清—室溫下?lián)]發(fā)乙醇—加入500μ1 TE，4°C過(guò)夜溶解DNA^加ΙΟμΙ RNase Α，顛倒混勻，并在55°C下保溫60min—加入1.25mL乙醇、54μ1 NaAc，沉淀DNA—離心30s，室溫下?lián)]發(fā)乙醇—DNA沉淀溶解在300μ1 TE中，最終獲得的全基因組將作為PCR反應(yīng)的模板；
[0062]步驟三:PCR反應(yīng)的確定:ΜΑΡ30的基因中沒(méi)有內(nèi)含子，可以直接從苦瓜全基因組中進(jìn)行擴(kuò)增，將按20μ1 PCR體系:CldH2O 7μ1、引物各Ιμ?、DNA模板Ιμ?、2 X Taq PCR MasterMix 1(^1配制，按卩0?反應(yīng)條件:951€511^11、(951€308，581€308，72 2min)35cycle ； 72°C7min，4°C⑴，進(jìn)行體外擴(kuò)增得到目標(biāo)MAP30的特異性片段；
[0063]弓I物設(shè)計(jì)為F15' - CGTCGACCTGTGGTATGCTTACTACTT-3/F25/ -GGAATTCTCAATTCACAACAGATTCC-37，引入的酶切位點(diǎn)為Sail和EcoRI ；
[0064]步驟四:TA克隆:PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行TA克隆，并導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽(yáng)性菌落，提取目標(biāo)DNA片段后進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系條件具體為:質(zhì)粒DNA 25yl，SalI和EcoRI分別Ιμ? ,Buffer 5yl，ddH20 5μ1，混勻，37°C Ih;
[0065]步驟五:表達(dá)載體的處理:過(guò)夜培養(yǎng)PET_28a菌株，后用試劑盒提取質(zhì)粒，并用與步驟四相同的兩種酶進(jìn)行酶切，表達(dá)質(zhì)粒雙酶切體系條件為:質(zhì)粒DNA 25yl，SalI和EcoRI分別Ιμ?，Buffer 5yl，ddH20 5μ1，混勻，37°C Ih;
[0066]步驟六:連接:經(jīng)步驟四與步驟五中相同酶處理后進(jìn)行連接，連接的ΙΟμΙ體系具體為:Solut1nI5yl，目標(biāo)DNA 3μ1，表達(dá)質(zhì)粒2ul，16°C過(guò)夜;
[0067]步驟七:將過(guò)夜連接的產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR，篩選出陽(yáng)性菌落；
[0068]步驟八:接著將陽(yáng)性菌落放大培養(yǎng)并在27°C條件下利用0.65mol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)4h ；
[0069]步驟九:在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)完畢后，收集菌體，然后用無(wú)菌水清洗3次，80Hz頻率下進(jìn)行超聲破碎，待到細(xì)菌全部破碎，溶液變清亮為止，然后在12000r/min離心15min，收集上清液，然后再利用鎳離子柱子手動(dòng)純化蛋白，上樣后先用50mmol/L PBS(pH7.4)，以60mL/min流速洗滌雜蛋白至基線，然后再分別用50、100和200mmol/L咪唑洗脫，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，接著收集得到純凈重組蛋白，冷凍干燥后4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0070]步驟十:制腸溶片:先稱(chēng)取大規(guī)模發(fā)酵得到的純凈苦瓜蛋白MAP3060g，與6g淀粉混勻，加10%的淀粉漿作粘合劑攪拌制成軟材，接著用14目尼龍篩制粒，將濕顆粒置于干燥器中60°C通風(fēng)干燥，過(guò)14目尼龍篩整粒，稱(chēng)干顆粒重量，加入顆粒量5%的滑石粉混勻，接著用壓片機(jī)壓片得到片芯，然后利用包腸溶衣處方制包衣液:Π號(hào)丙烯酸樹(shù)脂2.5kg、蓖麻油0.75kg、95%的乙醇35kg、鄰苯二甲酸二乙酯0.5kg、聚山梨酯-800.35kg，先將Π號(hào)丙稀酸樹(shù)脂和95%乙醇按1:14重比例溶解制成5%樹(shù)脂溶液，再將鄰苯二甲酸二乙酯、聚山梨酯-80、蓖麻油按